竹節(jié)參皂苷類化合物HPLC指紋圖譜研究

鄒海艷 劉珊珊 李 佳 馬 晗 趙 暉

（首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京，100069）

竹節(jié)參皂苷類化合物HPLC指紋圖譜研究

鄒海艷 劉珊珊 李 佳 馬 晗 趙 暉

（首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京，100069）

目的：建立竹節(jié)參藥材皂苷類成分HPLC指紋圖譜的研究方法，為竹節(jié)參藥材的質量控制提供依據。方法：采用Hibar C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，以乙腈-0.1%的磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測波長203 nm，柱溫30℃；測定了7批市售竹節(jié)參藥材的HPLC指紋圖譜。結果：竹節(jié)參的指紋圖譜共檢出12個共有峰，通過對照品比對指認了其中的7個共有皂苷類成分，7批藥材中有6批相似度均達到0.9以上。結論：該方法精密度、穩(wěn)定性、重復性好，特征性及專屬性強，可用于竹節(jié)參藥材的質量控制。

竹節(jié)參；皂苷類化合物；HPLC；指紋圖譜

竹節(jié)參，又名竹節(jié)人參、竹節(jié)三七、白三七，是五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japonicus C.A.Mey的干燥呈竹鞭狀的根莖。竹節(jié)參收載于1977年以后的各版《中華人民共和國藥典》，具有滋補強壯，有散瘀止痛，止血祛痰的功效，常用于治療病后虛弱，勞嗽咯血，咳嗽痰多，跌撲損傷等證［1-2］。竹節(jié)參中主要含有皂苷類化合物、多糖、揮發(fā)油、氨基酸等成分，現代藥理研究表明，皂苷類化合物是竹節(jié)參中的主要有效成分，在中樞神經系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等方面均有較好的活性［3-5］。竹節(jié)參中的皂苷類成分主要為齊墩果烷型和達瑪烷型三萜皂苷，其中以齊墩果烷型皂苷含量為高，包括竹節(jié)參皂苷Ⅳa，Ⅴ，Ⅰb，Ⅳ等［5］。竹節(jié)參廣泛分布于我國云南、四川、湖北、貴州等省，是民間常用中草藥，但迄今為止，《中華人民共和國藥典》尚未建立相應的質量控制標準，本文在前期化學成分研究的基礎上，針對竹節(jié)參中的皂苷類化合物，進行了HPLC指紋圖譜的研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent HP 1260高效液相色譜儀，配有自動進樣器、柱溫箱及DAD檢測器；舒美雙頻數控超聲波清洗器（KQ-500VDE，昆山市超聲儀器有限公司），RT-04高速粉碎機，賽多利斯萬分之一分析天平。

1.2 試劑 乙腈（Caledon，色譜純），娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。人參皂苷Rb1（批號：110704～201122）、人參皂苷Rg1（批號：110703～201027）、人參皂苷Rd（批號：111818～2010001）、人參皂苷Re（批號：110754～200822）、竹節(jié)參皂苷IVa（批號：111861～201001），均為含量測定用，購于中國藥品生物制品檢定所；人參皂苷R0（批號：MUST-12010503，純度＞98%，購于北京世紀奧科生物技術有限公司）；巨花雪膽皂苷B（自制）、Cynarasaponin C（自制）、竹節(jié)參皂苷IV（自制）。

1.3 藥材 7批竹節(jié)參藥材分別購于廣西（S1）、四川（S2）、云南（S3）、陜西（S4，S5）、湖北（S6）、湖北恩施（S7）；由首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院李佳副教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Hibar C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30 min，19%～19%A；30～35 min，19%～23%A；35～63 min，23%～32%A；63～85 min，32%～70%A）；流速1.0 mL·min-1，檢測波長203 nm，柱溫30℃，進樣量10μL。

2.2 對照品溶液的制備 分別取人參皂苷Rg1、Re、R0、Rb1、Rd、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、Ⅳ、cynarasaponin C、巨花雪膽皂苷B適量，用甲醇溶解制成混合對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取竹節(jié)參藥材，粉碎，過60目篩，取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇30倍量，稱重，超聲提取1 h，放至室溫，補足失重，過濾，取續(xù)濾液用0.45μm濾膜濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度實驗 取同一竹節(jié)參供試品溶液適量，連續(xù)進樣6次，按上述色譜條件測定，以竹節(jié)參皂苷Ⅳa為參照物，測得各共有峰的相對保留時間RSD≤0.60%，相對峰面積RSD≤1.02%，符合指紋圖譜研究技術要求。

2.4.2 重復性試驗 取同一竹節(jié)參藥材樣品6份，按上述方法平行制備供試品液，并進行測定，以竹節(jié)參皂苷Ⅳa為參照物，測得各共有峰的相對保留時間RSD≤0.17%，相對峰面積RSD≤2.72%，符合相關要求。2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一竹節(jié)參供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，20 h進行測定，以竹節(jié)參皂苷Ⅳa為參照物，測得各共有峰的相對保留時間RSD≤0.60%，相對峰面積RSD≤2.18%，表明樣品溶液20 h內穩(wěn)定。

2.5 竹節(jié)參皂苷類成分指紋圖譜的建立

2.5.1 共有峰的確定和化合物的指認 按2.1項下色譜條件，分別對7批竹節(jié)參藥材樣品進行HPLC分析，記錄圖譜（見圖1），采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”軟件進行數據處理，以平均數生成竹節(jié)參皂苷類成分的指紋圖譜，經分析確定指紋圖譜中有12個峰為共有特征峰，即1～12號峰（見圖2）。采用混合對照品對照（見圖3），指認了其中的7個共有峰，即2～4號、6號、10～12號共有峰分別為人參皂苷Rg1、Re、Rb1、R0、竹節(jié)參皂苷Ⅳ、人參皂苷Rd和竹節(jié)參皂苷Ⅳa，由圖可知，6，9，10，12峰為主要的共有峰，峰面積平均值約為總峰面積的90.19%。

2.5.2 不同批次竹節(jié)參藥材指紋圖譜相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”軟件對7批竹節(jié)參藥材的指紋圖譜進行分析，結果7批竹節(jié)參藥材（S1～S7）相似度分別為0.999，0.986，0.966，0.997，0.958，0.959，0.702。除購于湖北恩施的樣品外，其余批次藥材的相似度均大于0.9，相似度良好。

圖1 7個批次竹節(jié)參藥材的HPLC指紋圖譜

圖2 竹節(jié)參藥材HPLC指紋圖譜

圖3 混合對照品溶液的HPLC圖譜

3 討論

1）實驗中對色譜條件進行了優(yōu)化，分別比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水為流動相的分離效果，結果以乙腈-0.1%磷酸水為流動相時，基線漂移小，色譜峰峰形較好。試驗還比較了203 nm，220 nm，254 nm，280 nm，320 nm，360 nm各檢測波長下的色譜圖，發(fā)現檢測波長為203 nm時，色譜峰數目最多，響應值高，同時考慮到皂苷類成分主要為末端吸收，并參考相關文獻［7］，故選擇203 nm為檢測波長。

2）實驗中考察了供試品液的制備方法，以竹節(jié)參皂苷Ⅳa的峰面積為指標，分別對藥材的提取方法（回流、浸漬、超聲），提取溶劑（95%、70%、35%甲醇和乙醇），以及提取時間（30 min，1 h，2 h）進行了考察，結果顯示，70%甲醇回流1 h和超聲1 h效果接近，超聲提取1 h和2 h無統(tǒng)計學意義，因此選擇70%甲醇超聲1 h進行提取。

3）近年來，竹節(jié)參藥材需求量不斷增漲，竹節(jié)參藥材產地較多，市場上野生和家種藥材并存，本實驗曾收集了10個不同批次的竹節(jié)參藥材，其中有3批樣品外形與竹節(jié)參相似，但HPLC譜圖中不含有上述特征峰，經顯微鑒別發(fā)現這些批次藥材粉末中無草酸鈣簇晶，不屬于人參屬植物，應為偽品；7批竹節(jié)參藥材檢測結果表明，湖北恩施（S7）所產竹節(jié)參藥材樣品出峰較多，含有巨花雪膽皂苷B、cynarasaponin C等皂苷，其主要色譜峰的峰面積也與其他樣品相差較大，相似度較低（0.702），可能與竹節(jié)參產地的生態(tài)環(huán)境、栽培年限、采收加工等因素有關［8-10］。以上結果說明市售的竹節(jié)參藥材存在一定的質量差異和摻偽情況，因此，亟需建立相應的質量控制方法。

4）本實驗建立了竹節(jié)參藥材皂苷類成分的HPLC指紋圖譜分析方法，并對其主要色譜峰進行了指認，結果表明竹節(jié)參藥材中主要皂苷類成分在色譜圖中分離度良好，方法的穩(wěn)定性、重復性、精密度符合要求，特征性及專屬性強，可用于竹節(jié)參藥材的質量控制。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部［S］.北京：化學工業(yè)出版社，2010：129.

［2］林先明，謝玲玲，由金文，等.竹節(jié)參名稱及基原考［J］.中藥材，2007，30（6）：742-743.

［3］李春艷，張杰，李勁平，等.竹節(jié)參化學成分與藥理活性研究進展［J］.中醫(yī)藥導報，2012，18（4）：68-70.

［4］歐陽麗娜，向大位，吳雪，等.竹節(jié)參化學成分及藥理活性研究進展［J］.中草藥，2010，41（6）：1023-1025.

［5］賀海波，許佳，王洪武，等.竹節(jié)參不同提取部位預處理對冠脈結扎誘導大鼠急性心肌缺血損傷的影響［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2011，33（14）：1462-1466.

［6］吳兵，陳新，張長春，等.竹節(jié)參化學成分研究［J］.天然產物研究與開發(fā)，2012，24（8）：1051-1054.

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［8］童學飛，尹文仲，陳科力.栽培和野生竹節(jié)參中人參皂苷含量比較［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17（10）：1919-1920.

［9］李玉洲，何毓敏，孫志偉，等.不同栽培年限竹節(jié)參中主要成分含量的動態(tài)變化［J］.安徽農業(yè)科學，2011，39（33）：20411-20413.

［10］關喬，張海濱，毛帥，等.鄂西竹節(jié)參野生品與栽培品的比較研究［J］.中藥材，2013，36（2）：171-175.

（2014-04-14收稿 責任編輯：曹柏）

Studies on the HPLC Fingerprints of Saponins in Rhizoma Panax Japonicus

Zou Haiyan，Liu Shanshan，Li Jia，Mahan，Zhao Hui
（School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Objective：To establish HPLC fingerprintmethod for quality control of saponins in Rhizoma Panax Japonicus.Methods：The HPLCmethod was conducted based on a Hibar C18（4.6 mm×250 mm，5μm）column，with acetonitrile-0.1%orthophosphoric acid as mobile phase by gradientelution.The detection wavelength was at203 nm.The flow ratewas1.0mL·min-1and the column temperature was 30℃.Seven samples from different sourceswere analyzed by HPLC.Results：Twelvemainmarker peakswere selected in the standard fingerprintand 7 peaksof saponinswere identified.The similarity of6 sampleswas over 0.9.Conclusion：The precision，repeatability and stability of themethod were up to standard，and thismethod can be used for quality evaluation of Rhizoma Panax Japonicus.

Rhizoma Panax Japonicus；Saponins；HPLC；Fingerprint

R282

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.10.033

國家自然科學基金（編號：81403095）；北京市屬高校青年拔尖人才培育項目（編號：CIT＆TCD201404175，CIT＆TCD201404184）；首都中醫(yī)藥護理專項（編號：12ZYH08）

鄒海艷（1974—），女，副教授，博士，主要研究方向：中藥質量控制，Tel：（010）83911671，E-mail：bwzhy＠sina.com

趙暉（1973—），女，副教授；碩士研究生導師；Tel：（010）83911633，E-mail：zhaohui8957＠sina.com