陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方對(duì)自然衰老圍絕經(jīng)期大鼠模型卵巢形態(tài)學(xué)和血清性激素水平的影響

白建民， 馮冬蘭， 王愛(ài)梅， 時(shí)偉紅， 未小明， 曾憲平

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河南 南陽(yáng) 473061)

本研究運(yùn)用陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方灌胃治療自然衰老大鼠圍絕經(jīng)期模型，觀察大鼠卵巢組織學(xué)改變，檢測(cè)其血清性激素(E2、FSH、LH)水平變化，評(píng)價(jià)陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方治療圍絕經(jīng)期綜合征的療效，探討其治療圍絕經(jīng)期綜合征的可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康雌性SD大鼠，11～15月齡，體質(zhì)量250 g～350 g，經(jīng)陰道細(xì)胞涂片連續(xù)5 d未出現(xiàn)動(dòng)情期變化大鼠30只；健康雌性SD大鼠10只，4～6月齡，體質(zhì)量120 g～180 g，由河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物與制劑

陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方組成：紫河車(chē)6 g,熟地15 g,麥冬12 g,石斛20 g,知母15 g,百合20 g,白芍15 g,女貞子12 g,山茱萸15 g,龜板膠15 g,鹿角膠6 g,菟絲子15 g,淫羊藿12 g,肉桂6 g,當(dāng)歸10 g,丹參15 g,川芎6 g,藏紅花6 g,山藥20 g,人參10 g,五味子10 g,郁金15 g,煅龍牡20 g，以上藥材均購(gòu)自南陽(yáng)醫(yī)專(zhuān)附屬中醫(yī)院中藥房，經(jīng)南陽(yáng)醫(yī)專(zhuān)中藥鑒定教研室姚學(xué)文副教授鑒定，符合2010年版《中國(guó)藥典》的相關(guān)規(guī)定。水煮法：按以上處方稱(chēng)取藥材，分別水煎煮2次，第1次加10倍量水煎煮40 min，第2次加8倍量水煎煮30 min，雙層紗布濾過(guò)，制成濃縮液，濃縮至生藥含量為5 g/L的濃縮液。尼爾雌醇由上海醫(yī)藥<集團(tuán)>有限公司華聯(lián)制藥廠生產(chǎn)(批號(hào)H31021648)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

E2、FSH、LH放射免疫分析試劑盒由北京邦定生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，SSW型微電腦電熱恒溫槽由上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)，LD4-2低速離心機(jī)由北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)(型號(hào)DZF-6020)，B×41-Olympus生物顯微鏡由南京長(zhǎng)城信息系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

將30只自然衰老圍絕經(jīng)期雌性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只，即圍絕經(jīng)期模型組、陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方組和雌激素對(duì)照組。另外選取4～6月齡健康SD雌性大鼠10只作為空白對(duì)照組。陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方組給予陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方5 g/kg濃縮液，2 ml/d灌胃；雌激素對(duì)照組每周1次給予尼爾雌醇和蒸餾水配制成1 mg/kg混懸液，2 ml/次灌胃，其余時(shí)間給予等量生理鹽水灌胃；圍絕經(jīng)期模型組和空白對(duì)照組每天給予等量生理鹽水2 ml/d灌胃，連續(xù)給藥4周。

2.2 觀測(cè)指標(biāo)與測(cè)定方法

各實(shí)驗(yàn)組大鼠末次灌胃治療后禁食12 h，用2.25%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)行腹腔麻醉，麻醉成功后剖腹，暴露腹主動(dòng)脈(色白)，頭皮靜脈穿刺針采血4 ml至生化檢測(cè)試管，室溫下靜置4～8 h，分離血清后放置于-20℃冰箱內(nèi)保存，嚴(yán)格按照放射免疫分析試劑盒測(cè)量方法分別測(cè)定FSH、LH、E2水平。采血結(jié)束后，放血處死大鼠摘取卵巢組織，制作卵巢石蠟切片，用光學(xué)顯微鏡觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)的改變。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方對(duì)模型大鼠卵巢形態(tài)學(xué)的影響

圖1顯示，空白對(duì)照組大鼠鏡下可見(jiàn)黃體發(fā)育良好、體積大、數(shù)目多、成熟卵泡多、閉鎖卵泡少見(jiàn)；與空白對(duì)照組比較，圍絕經(jīng)期模型組大鼠鏡下可見(jiàn)閉鎖卵泡增多，成熟卵泡數(shù)量明顯減少，黃體數(shù)目少，體積小；與圍絕經(jīng)期模型組比較，用藥組鏡下均可見(jiàn)黃體數(shù)目明顯增多，閉鎖卵泡數(shù)量減少，提示陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方組和雌激素對(duì)照組對(duì)卵巢萎縮現(xiàn)象均有改善作用。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢組織切片HE染色結(jié)果

3.2 陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方對(duì)模型大鼠性激素水平的影響

表1顯示，圍絕經(jīng)期模型組大鼠血清E2水平低于空白對(duì)照組，血清FSH、LH值則明顯高于正常組(P<0.05，P<0.01)；與圍絕經(jīng)期模型組比較，陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方組和雌激素對(duì)照組均能提高圍絕經(jīng)期大鼠血清E2水平，降低圍絕經(jīng)期大鼠血清FSH、LH值(P<0.01)，且2組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清性激素檢測(cè)結(jié)果

注：與空白對(duì)照組比較：##P<0.01；與圍絕經(jīng)期模型組比較：**P<0.01

4 討論

卵巢功能衰退可使卵巢分泌卵泡數(shù)量減少，合成性激素量不足，血中雌-孕激素水平下降，導(dǎo)致下丘腦、垂體功能衰退，是圍絕經(jīng)期婦女內(nèi)分泌失調(diào)的主要原因。目前，西醫(yī)治療主要采用激素替代療法防治圍絕經(jīng)期綜合征，療效肯定，但長(zhǎng)期激素治療可能增加子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1]。

圍絕經(jīng)期綜合征屬于中醫(yī)“絕經(jīng)前后諸證”范疇。中醫(yī)認(rèn)為，絕經(jīng)前后人體腎氣逐漸衰退，天癸漸竭，沖任二脈俱虛，極易導(dǎo)致腎的陰陽(yáng)平衡失調(diào)。但通過(guò)長(zhǎng)期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，腎陰陽(yáng)俱虛患者單純雙補(bǔ)陰陽(yáng)療效不佳。腎為沖任之本，胞絡(luò)系于腎而絡(luò)于胞中，腎陰虛則精虧血少；腎陽(yáng)虛則虛寒內(nèi)生，沖任、胞宮失煦，以致寒凝血瘀，沖任、胞宮氣血運(yùn)行失暢。《景岳全書(shū)·命門(mén)敘》亦曰：“命門(mén)為精血之海……為元?dú)庵迮K之陰氣非此不能滋；五臟之陽(yáng)氣非此不能發(fā)。”可見(jiàn)腎為五臟陰陽(yáng)之本,氣血之根。絕經(jīng)前后腎陰陽(yáng)俱虛者，不僅腎之陰陽(yáng)虧虛、失衡且波及氣血，使氣血亦虛、沖任瘀滯，并累及心肝脾諸臟，臨床常表現(xiàn)為復(fù)雜多樣的變化和證候。劉完素在《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集》中就曾指出：“……天癸已絕，乃屬太陰經(jīng)也。”強(qiáng)調(diào)了此期腎氣漸衰，沖任漸虛，全靠補(bǔ)后天養(yǎng)先天，充養(yǎng)沖任氣血，以延緩衰老的重要性。此期雙理陰陽(yáng)氣血、健脾益氣、疏肝解郁、養(yǎng)心安神，多臟兼顧更適合其復(fù)雜的生理病理變化需求。陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方正是基于以上理論，著重陰陽(yáng)雙補(bǔ)、氣血并調(diào)，并輔以健脾益氣、疏肝解郁、養(yǎng)心安神、育陰潛陽(yáng)諸法，以適應(yīng)此期的復(fù)雜病機(jī)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，多臟并調(diào)，重在脾腎，雙理氣血可恢復(fù)腎之陰陽(yáng)平衡，重現(xiàn)臟腑正常功能，較之單純雙補(bǔ)陰陽(yáng)之法更適合圍絕經(jīng)期的生理病理變化。

現(xiàn)代藥理研究表明，紫河車(chē)能直接刺激卵巢組織，提高E2水平，并能補(bǔ)充適量的女性荷爾蒙[2]；百合、知母有雌激素樣活性，能調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和改善圍絕經(jīng)期綜合征大鼠臨床癥狀[3]；淫羊藿主要成分黃酮苷，具有雌激素樣作用[4]；菟絲子可提高下丘腦-腦垂體-卵巢對(duì)LRH和LH的反應(yīng)性，增加實(shí)驗(yàn)大鼠垂體前葉、卵巢、子宮重量[5]；紅花能降低圍絕經(jīng)期綜合征患者血清FSH、LH含量，增加血清E2含量[6]。因此，有必要進(jìn)一步探討陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方調(diào)節(jié)生殖軸的作用機(jī)制，為中醫(yī)理論的開(kāi)拓性運(yùn)用、替代性激素治療、新藥的開(kāi)發(fā)提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，陰陽(yáng)氣血雙調(diào)復(fù)方和雌激素一樣對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的失衡狀態(tài)有明顯調(diào)節(jié)作用，能提高血清E2水平，降低血清FSH、LH含量，改善卵巢功能，促進(jìn)排卵，為該方的臨床應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 張鴻宇,羅曉.左歸丸合逍遙丸治療圍絕經(jīng)期綜合征[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012， 18(12):295-297．

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[3] 錢(qián)莉亞,許惠琴,嚴(yán)然,等.百合知母湯治療圍絕經(jīng)期綜合征的實(shí)驗(yàn)研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,26(3)：202-205．

[4] 曹秀梅,潘玉華.龍鳳寶片治療圍絕經(jīng)期綜合征的再評(píng)價(jià)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2012,18(24): 324-326.

[5] 秦達(dá)念,佘白蓉,佘運(yùn)初.菟絲子黃酮對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人絨毛組織生殖功能的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2000，11(6):349-351.

[6] 王娟.紅花逍遙片治療圍絕經(jīng)期綜合征35例[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(18)：312-313.