非酒精性脂肪性肝炎患兒血清腫瘤壞死因子α與細胞角質蛋白18的表達及意義研究

李 娜，周明錦，陳 楠

兒童非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)包括以三酰甘油(TG)在肝臟中堆積為特征的獨立肝細胞脂肪變性、由相連的脂質積累引起肝細胞損傷和炎癥及各種程度的纖維化為特征的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)[1]。即使是兒童NASH，也可以進展為肝硬化，并引起一系列并發癥。目前，NASH診斷的金標準是肝組織活檢。然而肝組織活檢是侵入性的，價格昂貴且可能導致并發癥。因此，不能很好地適用于篩查和監測兒童大多無癥狀的非酒精性脂肪肝[2]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)主要在肝臟內的單核巨噬細胞中產生，在炎癥反應中起到關鍵性作用。最近發展出一項替代篩選試驗：測量血漿中細胞角蛋白18(CK-18)的水平[3]。CK-18是肝臟中的主要中間絲蛋白。與脂肪有關的損害導致細胞受傷，進而凋亡，半胱天冬酶裂解CK-18進入血液。這種凋亡與NASH相關，但與肝脂肪變性無關，因此血液中CK-18能區分兩種不同NAFLD病變[4]。CK-18一直作為成人NASH生物標志物被廣泛地研究，并證明能夠區別脂肪性肝炎。研究表明細胞損傷后TNF-α的增加常會伴有CK-18水平的升高，兩者可能存在協同作用，參與并促進NASH的發生與發展[5]。因此，本研究通過檢測血清TNF-α和CK-18水平，評估其作為兒童NASH非侵入性生物標志物的效果，并評估其與組織學檢查結果的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年2月—2013年3月在鄭州市兒童醫院內科住院、肝組織活檢證實為NAFLD的患兒88例為研究對象，其中男57例，女31例；年齡9～13歲，平均(10.6±2.4)歲。入選標準：(1)肝組織活檢證實為NAFLD；(2)肝臟超聲為彌漫性高回聲并提示脂肪肝；(3)血清轉氨酶水平持續升高。排除標準：(1)實驗室檢查證實為病毒性肝炎患兒；(2)飲酒、腸外營養史及使用已知藥物誘發脂肪肝者；(3)自身免疫性肝病及代謝性肝病；(4)α-1-抗胰蛋白酶相關肝病。患兒及家屬均簽署知情同意書。

1.2 一般指標檢測 測量患兒身高、體質量并計算體質指數(BMI)，根據美國兒童肥胖專家委員會推薦的兒童肥胖診斷標準，BMI大于或等于同年齡同性別人群第95百分位數值為肥胖。代謝綜合征診斷標準：符合以下5條中3條即可定義：(1)肥胖(腰圍≥同年齡、同性別第90百分位)。(2)TG≥同年齡、同性別第90百分位。(3)高密度脂蛋白(HDL)≤同年齡、同性別第10百分位。(4)血壓≥同年齡、同性別第90百分位。(5)餐前血糖升高。測量非同日3次患兒清晨靜息血壓，根據世界衛生組織(WHO)推薦的關于兒童高血壓診斷標準統計患有高血壓的人數。胰島素抵抗指數(HOMA-IR) =(空腹外周血糖×胰島素)/22.5。

1.3 血清學指標測量 取患兒清晨空腹靜脈血10 ml置于抗凝管中，于離心機3 000 r/m離心15 min(離心半徑7.5 cm)后取上層血清液置于-20 ℃凍存備檢。采用全自動生化分析儀檢測總膽固醇(TC)、TG、清蛋白、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平。根據酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明書檢測血清TNF-α和CK-18水平，檢測試劑緩沖液配方為0.132 mol/L Tris-HCl(pH 8.5)、2.63 mol/L氯化鈉(NaCl)、1.32 mmol/L氯化鈣(CaCl2)。當患兒TC、TG水平高于同齡兒童第75百分位數值時則認為患兒有高膽固醇血癥及高三酰甘油血癥。

1.4 肝組織活檢 對符合臨床適應證的患兒進行肝組織活檢，以評估NASH和纖維化程度，或其他可能獨立或合并的肝病。肝組織活檢：禁食一夜后，使用自動芯活檢18號針在全身麻醉及超聲指導下進行。記錄肝標本的長度。選取連續的長度15 cm以上，并包括至少6個完整的肝小葉樣品。樣品采用甲醛溶液固定后進行石蠟包埋，切片5 μm厚，用蘇木素-伊紅染色。根據Brunt等[6]提出的NAFLD活動性評分系統(NAS)進行分級：(1)脂肪變(0～2分)：5%～33%、34%～65%、≥66%，(2)小葉炎癥(0～3分)：無病灶、<2個病灶、2～4個病灶、>4個病灶，(3)匯管區炎癥(0～2分)：無、輕、中/重，(4)氣球樣變(0～2分)：無、少許、較多。4項評分之和(NASH炎癥評分)≥6分診斷為NASH，否則為非NASH。

2 結果

2.1 NASH組及非NASH組患兒一般資料比較 NASH組64例，非NASH組24例。兩組患兒性別、年齡、BMI、高血壓發生率、HOMA-IR、清蛋白水平、高三酰甘油血癥發生率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。而NASH組肥胖、代謝綜合征、高膽固醇血癥發生率，TC、TG、AST、ALT、TNF-α、CK-18水平高于非NASH組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 兩組患兒病理資料比較 NASH組與非NASH組患兒不同程度脂肪變、小葉炎癥、匯管區炎癥、氣球樣變發生率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。NASH組患兒NASH炎癥評分高于非NASH組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 血清TNF-α、CK-18水平與NASH炎癥評分的相關性 Spearman相關分析顯示，血清TNF-α、CK-18水平與NASH炎癥評分均呈正相關(rs=0.69，P<0.05；rs=0.73，P<0.05)。

以NASH炎癥評分為因變量，TNF-α為自變量，行直線回歸分析，兩者的直線回歸方程為：NASH炎癥評分=0.05×TNF-α-2.08，差異有統計學意義(F=114.24，P=0.000)。以NASH炎癥評分為因變量，CK-18為自變量，行直線回歸分析，兩者的直線回歸方程為：NASH炎癥評分=0.1×CK-18+0.58，差異有統計學意義(F=125.15，P=0.000)。

2.4 NASH組不同病理特征患兒TNF-α、CK-18水平比較 不同程度脂肪變、小葉炎癥、匯管區炎癥、氣球樣變NASH組患兒TNF-α水平比較，差異均有統計學意義(F值分別為4.15、6.93、5.80和7.18，P值分別為0.04、0.01、0.02和0.00)；NASH組患兒隨著脂肪變、小葉炎癥、匯管區炎癥、氣球樣變程度的加重TNF-α水平逐漸升高，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05，見圖1)。不同程度脂肪變、小葉炎癥、匯管區炎癥、氣球樣變NASH組患兒CK-18水平比較，差異均有統計學意義(F值分別為6.72、5.93、6.13和5.58，P值分別為0.01、0.02、0.02和0.03)；NASH組患兒隨著脂肪變、小葉炎癥、匯管區炎癥、氣球樣變程度的加重CK-18水平逐漸升高，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05，見圖2)。

2.5 NASH組患兒脂肪變、小葉炎癥、匯管區炎癥、氣球樣變程度與TNF-α、CK-18水平相關性分析 Spearman相關分析結果顯示，NASH組患兒脂肪變、小葉炎癥、匯管區炎癥、氣球樣變程度與TNF-α、CK-18水平均呈正相關(P<0.05，見表3)。

2.6 ROC曲線下面積分析 以TNF-α、CK-18水平為檢驗變量，以病理診斷結果為狀態變量做ROC曲線，TNF-α ROC曲線下面積為0.83，CK-18 ROC曲線下面積為0.92。取TNF-α截點值為136 μg/L時，可獲得最佳靈敏度0.79和特異度0.75。取CK-18截點值為42 μg/L，可獲得最佳靈敏度0.82和特異度0.85(見圖3)。

表1 NASH組及非NASH組患兒一般資料比較Table 1 Comparison of basic data between NASH group and non-NASH group

注：BMI=體質指數，HOMA-IR=胰島素抵抗指數，TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，AST=天冬氨酸氨基轉移酶，ALT=丙氨酸氨基轉移酶，TNF-α=腫瘤壞死因子α，CK-18=細胞角質蛋白18；*為χ2值，△為U值，余檢驗統計量值為t值

表2 NASH組與非NASH組患兒病理資料比較Table 2 Comparison of pathological data between NASH group and non-NASH group

注：*為t值

圖1 NASH組不同病理特征患兒TNF-α水平比較Figure 1 Comparison of TNF-α levels in children with different pathological features in NASH group

圖2 NASH組不同病理特征患兒CK-18水平比較Figure 2 Comparison of CK-18 levels in children with different pathological features in NASH group

表3 NASH組患兒脂肪變、小葉炎癥、匯管區炎癥、氣球樣變程度與TNF-α、CK-18水平相關性分析

Table3 Correlation analysis on TNF-α and CK-18 levels with different degrees of pathological features in children in NASH group

病理類型TNF-αrs值(95%CI) P值CK-18rs值(95%CI) P值脂肪變0 72(0 61，0 81)<0 050 78(0 67，0 86)<0 05小葉炎癥0 46(0 33，0 56)<0 050 55(0 41，0 63)<0 05匯管區炎癥0 58(0 44，0 68)<0 050 49(0 36，0 62)<0 05氣球樣變0 74(0 61，0 85)<0 050 79(0 61，0 85)<0 05

3 討論

NAFLD被越來越多的學者認為是胰島素抵抗和代謝綜合征在肝臟的體現。NASH可能是成人慢性肝臟疾病最常見的形式。NASH是NAFLD的一種類型，已被證實有可能進展為肝硬化和肝癌。現在NASH還被認為是進展型的脂肪肝疾病。組織學診斷仍然是評估NASH炎癥及纖維化程度的準確手段。Matteoni等[7]研究表明21%～28%的肝硬化患者肝組織活檢可以表現為肝脂肪變、炎癥、氣球樣變及纖維化的綜合狀態。研究表明，血清TNF-α和CK-18水平常與肝細胞損傷相關[8]。為了找到一種非侵入性的評估及診斷NASH的方法，本研究通過檢測血清TNF-α和CK-18水平，評估其作為兒童NASH非侵入性生物標志物的效果，并評估其與組織學檢查結果的相關性。

注：A為TNF-α；B為CK-18

圖3 TNF-α、CK-18診斷NASH的ROC曲線

Figure3 ROC curve of TNF-α and CK-18 in diagnosing NASH

TNF-α可以通過激活神經鞘磷脂酸來抑制細胞線粒體呼吸鏈的電子傳遞過程，使得線粒體內的活性氧生成增多，促使肝細胞的炎癥發生及壞死[9]。肝細胞的炎癥和壞死同時能促進TNF-α的表達，使其產生“二次打擊”[10]。TNF-α同時也被證實在胰島素抵抗機制中起關鍵作用，不僅與葡萄糖和脂類代謝紊亂有關，還參與到從脂肪肝發展為NASH再到肝纖維化的整個病理過程。CK-18在皮脂腺、消化道腫瘤、前列腺癌組織中表達[11]。CK-18同時在細胞凋亡后被釋放入血液中。在肝細胞受到損害后，細胞凋亡激活細胞內溶解酶系統，使得微絲網狀結構水解斷裂并將CK-18釋放入血液中，CK-18可以反映細胞凋亡的水平[12]。

TNF-α作為一種細胞炎性遞質、CK-18作為肝細胞凋亡的標志物均在診斷兒童NASH中具有較高的準確度，本研究結果表明，NASH組患兒TNF-α、CK-18水平高于非NASH組。TNF-α、CK-18診斷NASH的ROC曲線下面積分別為0.83、0.92。TNF-α、CK-18水平與肝組織活檢的NASH患兒病理特征程度、NASH炎癥評分均呈正相關。許多研究表明，CK-18在成人NASH的診斷中具有較好的準確度[13]。有研究表明CK-18水平每升高50 μg/L，其發生NASH的危險度增加1.7倍[14]。近期也有Meta分析指出CK-18預測成人NASH的平均ROC曲線下面積為0.82，TNF-α預測成人NASH的平均ROC曲線下面積為0.78[15]。最近有兩項關于評估血漿CK-18對兒童NAFLD疾病嚴重程度預測價值的研究。Fitzpatrick 等[16]指出NASH患兒CK-18水平中位數顯著高于有脂肪肝的NAFLD患兒。Lebensztejn等[17]指出CK-18可以作為肝纖維化的標志蛋白之一，其發現肝纖維化評分越高的患者CK-18水平越高。上述的研究樣本量均較小，且血漿獲取時間和活檢時間存在差異，這使得其結果可信度有所下降。本試驗選取相對多的樣本量，在肝組織活檢的當天取患兒靜脈血檢測，并根據代謝綜合征的危險因素進行匹配。

綜上所述，血清TNF-α和CK-18水平能夠較好地在NAFLD疾病譜中預測存在NASH。其可以作為一種非侵入式的評估方法來診斷NASH，為早期的臨床干預提供指導。在未來的研究中，我們將評估TNF-α和CK-18的縱向變化與疾病發展和治療干預的反應性變化，以便為臨床的治療提供更全面有力的證據。

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