難治性癲癇細胞模型中N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶Vb和肌營養不良蛋白聚糖基因的表達變化及意義

葉潔梅，吳 原，黃金山，李偲俊，韋 興，劉 云

癲癇是神經系統的常見病、多發病。目前難治性癲癇的發病機制尚未十分清楚，突觸重建是其重要的病理基礎之一[1]。研究表明，N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶Vb(N-acetylglucosaminyltransferase Vb，GnT-Vb)和肌營養不良蛋白聚糖(dystroglycan)是重要的神經元表面受體，可與細胞外基質成分如層黏連蛋白、纖維連接蛋白等結合，介導細胞之間的黏附，參與細胞外環境信息交換，維持細胞骨架，影響神經元極性，參與神經突觸的形成及突觸后介質的成熟等[2]。本研究擬觀察難治性癲癇細胞模型(Sombati癲癇細胞模型)中GnT-Vb和dystroglycan基因的表達變化，探討二者在癲癇形成過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：新生24 h內的SD乳鼠，SPF級，雌雄不限。(2)主要試劑：DMEM/F12培養基、胎牛血清、NEUROBASAL Medium培養液、B27 Supplement(GIBICO)；Trizol、SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen公司)；SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司)。(3)主要儀器設備：熒光定量PCR儀(ABI7500 Fast)；熒光顯微鏡(Olympus公司)； 二氧化碳(CO2)培養箱(Thermo公司)等。

1.2 方法

1.2.1 原代海馬神經元分離培養與鑒定 取新生24 h內SD乳鼠，于75%乙醇中浸泡消毒。斷頭取腦，置于預冷的D-Hank′s液中。分離雙側海馬，剔除腦膜后剪碎組織，用0.125%胰蛋白酶于37 ℃的恒溫水浴箱消化15 min。小心吸出胰酶后，加入5 ml種植培養液終止消化。漂洗2次，巴氏滴管輕柔吹打20次，1 000 r/min離心5 min棄上清液，重懸于種植培養液中。以200目篩網過濾，調整細胞密度為1×109/L。1.5 ml/孔移入經0.1%多聚賴氨酸包被過的6孔細胞培養板，置37 ℃ 5%CO2細胞培養箱內培養12 h后，全量更換為無血清維持培養液2 ml繼續培養。每天觀察細胞生長情況，每3 d半量換液1次。

種植培養液配制：90%DMEM/F12培養基，10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素。無血清維持培養液的組成：98%NEUROBASAL Medium培養液，2%B27 Supplement，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素。于第7天采用神經微絲免疫組化染色鑒定神經元(按說明書操作)，取純度≥95%的細胞用于后繼實驗研究。

1.2.2 Sombati癲癇細胞模型的構建 將培養至第14天的海馬神經元隨機分為對照組和模型組，每組設6孔，重復實驗3次。對照組更換為正常細胞外液培養3 h后恢復無血清維持培養液培養，模型組則更換為低鎂細胞外液培養3 h后恢復無血清維持培養液培養。正常細胞外液(mmol/L)的配制：NaCl 145 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，HEPES緩沖液 10 mmol/L，CaCl22 mmol/L，葡萄糖 10 mmol/L，甘氨酸 0.002 mmol/L，MgCl21 mmol/L，溶解于1 000 ml三蒸水，調pH值至7.0～7.2，過濾除菌。低鎂細胞外液(mmol/L)的配制：NaCl 145 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，HEPES緩沖液10 mmol/L，CaCl22 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，甘氨酸0.002 mmol/L，溶解于1 000 ml三蒸水，調pH值至7.0～7.2，過濾除菌。

1.2.3 通過實時定量聚合酶鏈式反應(real-time qPCR)方法檢測Sombati癲癇細胞模型中GnT-Vb和dystroglycan基因表達。

1.2.3.1 細胞樣品總RNA的提取 每10 cm2細胞加入1 ml Trizol液，用槍頭吹吸混勻，盡量讓細胞全部裂解，室溫放置5 min，每管中各加入0.2 ml氯仿，蓋緊離心管，反復顛倒混勻15 s，12 000×g，4℃離心10 min，取上層水相于離心管中。每管中各加0.5 ml異丙醇，輕輕混勻，室溫放置10 min，12 000×g，4 ℃離心10 min，棄去上清液。每管中加入1 ml的75%乙醇輕輕洗滌沉淀，12 000×g，4 ℃離心10 min，小心棄去上清液。室溫干燥5～10 min，RNA溶于50～100 μl水中。

1.2.3.2 反轉錄cDNA 按照SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書操作，取無RNA酶的eppendorf管，每個樣本加入如下組分(Mix ×1)：RNA 2 μl，5×VILO Reaction Mix 4 μl，10×SuperScript Enzyme Mix 2 μl，DEPC-treated water 12 μl，總體系20 μl。輕輕混勻后，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，85 ℃孵育5 min終止反應。所得到的cDNA保存在-20 ℃備用。

1.2.3.3 Real-time qPCR檢測目的基因的表達 檢測細胞樣品中目的基因和內參基因(GAPDH基因)的表達量。體系中各組分的體積如下：超純水5.7 μl，2×SYBR Green PCR Master Mix 7.5 μl，上游引物(10 μmol/L)0.15 μl，下游引物(10 μmol/L)0.15 μl，模板1.5 μl，總體系15 μl(見表1)。反應條件：95 ℃預變性10 min，40個循環；95 ℃變性15 s；60 ℃退火延伸60 s。根據qPCR反應曲線得到各樣品目的基因和內參基因的循環閾值(Ct值)，數據分析使用QIAGEN公司RT2 Profiler PCR Array Data Analysis系統。

表1 GnT-Vb和dystroglycan基因檢測用引物序列(5′-3′)

Table1 Primer sequences for the gene expression detection of GnT-Vb and dystroglycan

引物名稱引物序列5′-3′GAPDH 上游ATGATTCTACCCACGGCAAG 下游CTGGAAGATGGTGATGGGTTGnT-Vb 上游ACGCCTACATCCAACACCAG 下游AACGGAGCTGATGTTCTGGGdystroglycan 上游CTCGTCCTGCCTTCTCCAATG 下游CGTCATCCTCACTGCTCTTCTC

注：GAPDH =內參，GnT-Vb=N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶Vb，dystroglycan=肌營養不良蛋白聚糖

2 結果

2.1 Sombati癲癇細胞造模后第1天GnT-Vb和dystroglycan基因表達變化 Sombati癲癇細胞造模后第1天，模型組GnT-Vb基因表達水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；而兩組dystroglycan基因表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

2.2 Sombati癲癇細胞造模后第4天GnT-Vb和dystroglycan基因表達變化 Sombati癲癇細胞造模后第4天，模型組GnT-Vb、dystroglycan基因表達水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

3 討論

GnT-Vb和dystroglycan是重要的跨膜糖蛋白，兩者均廣泛表達于神經系統，是連接細胞外基質和細胞骨架蛋白的重要分子結構，影響神經元的分化、遷移，在神經生長發育過程中起重要作用。GnT-Vb和dystroglycan不僅參與神經系統的發育和可塑性，而且與成熟神經元的病理狀態密切相關。

癲癇的反復放電造成神經突起-生長錐異常生長最終形成異常的神經網絡，是癲癇難治性形成的基礎。研究發現，Sombati癲癇細胞模型中層黏連蛋白、整合素呈高表達，經低鎂細胞液處理72 h后Sombati癲癇細胞出現明顯的形態學改變，表現為部分神經元胞體相融合，神經突起遷徙靠近，神經元之間出現網格變化，異常神經網絡形成[3-4]。生長錐表面的整合素胞外段在層黏連蛋白等因子的作用下使生長錐黏附于細胞外基質上，引起微絲和微管運動，啟動胞內各級信號轉導系統，直接調節細胞骨架，最終引起神經突起的生長、延伸和神經纖維的發芽，提示層黏連蛋白-整合素跨膜系統是難治性癲癇形成異常網絡的關鍵。Dystroglycan作為層黏連蛋白的重要受體之一，可參與神經元的軸突靶向和髓鞘形成過程。Berti等[5]研究發現，當dystroglycan和整合素兩者同時缺失時，層黏連蛋白介導的絲裂原活化蛋白激酶p38磷酸化受抑制，提示dystroglycan和整合素兩者可能共同參與層黏連蛋白介導的絲裂原活化蛋白激酶p38磷酸化過程，影響神經元的軸突靶向和髓鞘形成。Lee等[6]報道，神經元表面的GnT-Vb可以通過影響整合素與細胞外基質的相互作用，進而影響酪氨酸的磷酸化，參與激活胞內多條信號轉導途徑，促進神經細胞突起生長和突觸形成。本實驗結果顯示，Sombati癲癇細胞造模后第4天，與正常海馬神經元比較，其GnT-Vb、dystroglycan基因表達水平均增高，提示GnT-Vb和dystroglycan可能同時參與了難治性癲癇的形成過程。

Sombati癲癇細胞模型是一種研究癲癇發病機制的理想模型，在低鎂細胞外液的作用下可形成持續的反復自發性癲癇樣放電。馬美剛等[7]研究發現，經低鎂細胞外液處理3 h后的Sombati癲癇細胞在3、6、24 h乳酸脫氫酶(LDH)活性均較對照組明顯升高，并隨著時間的延長，LDH的釋放量呈逐漸上升趨勢，提示Sombati癲癇細胞存在早期損傷作用。趙文元等[8]研究同樣發現Sombati癲癇細胞在產生癲癇樣放電早期可引起可神經元的壞死，于3～24 h內明顯，其中6 h達最高峰，推測神經元在低鎂狀態下早期持續激烈的癲癇樣放電可能引起線粒體通透性改變，神經元內ATP大量消耗，部分神經元發生應激損傷，甚至由于ATP 的耗竭引起急性神經元壞死。本實驗結果顯示，在Sombati癲癇細胞產生癲癇樣放電后第1天，與正常海馬神經細胞比較，其GnT-Vb表達水平降低，而dystroglycan基因表達水平無差異，可能是由于Sombati癲癇細胞早期產生持續劇烈的癲癇樣放電時引起神經元急性氧化應激、損傷，阻斷了各種活性因子往返轉運，引起細胞營養與代謝紊亂，導致造模后早期神經元內某些功能蛋白合成的短暫的反應性降低。總之，GnT-Vb和dystroglycan基因在Sombati癲癇細胞模型中的表達呈現一定的動態變化，隨著時間的延長，二者基因表達水平逐漸增高。提示GnT-Vb和dystroglycan基因可能參與了難治性癲癇的形成過程，尤其是細胞持續自發性放電后的后期異常神經網絡的重組過程。

表2 造模后第1天對照組和模型組GnT-Vb和dystroglycan基因表達水平比較(n=6)

Table2 Comparison of mRNA expression levels of GnT-Vb and dystroglycan between control group and experimental group on the first day after model establishment

組別GnT-VbAVGΔCt 2-ΔΔCt 倍數變化 t值 P值dystroglycanAVGΔCt 2-ΔΔCt 倍數變化 t值 P值對照組模型組6 29±0 037 12±0 140 0127520 0071720 56-10 3550 0003 84±0 063 97±0 080 0698490 0639420 92-2 2310 090

注：倍數變化為模型組2-ΔΔCt/對照組2-ΔΔCt

表3 造模后第4天對照組和模型組GnT-Vb和dystroglycan基因表達水平比較(n=6)

Table3 Comparison of mRNA expression levels of GnT-Vb and dystroglycan between control group and experimental group on the fourth day after model establishment

組別GnT-VbAVGΔCt 2-ΔΔCt 倍數變化 t值 P值dystroglycanAVGΔCt 2-ΔΔCt 倍數變化 t值 P值對照組模型組7 40±0 006 43±0 090 0059320 0116311 9618 6280 0003 80±0 053 30±0 090 0719050 1017581 428 8150 001

癲癇的形成過程是一個受多種因子共同參與的復雜過程，不僅涉及神經元之間、神經元與膠質細胞之間的相互作用，而且還涉及許多生物活性分子之間復雜的相互調控機制。GnT-Vb和dystroglycan可能同時參與了癲癇的形成過程，但仍需要更深入的研究以闡明GnT-Vb和dystroglycan相關的信號轉導通路及其與整合素-層黏連蛋白跨膜系統的相互作用，從而進一步闡明癲癇的形成機制，有可能為難治性癲癇的治療提供一個新的靶點。

1 Casillas-Espinosa PM，Powell KL，O′Brien TJ. Regulators of synaptic transmission：roles in the pathogenesis and treatment of epilepsy[J]. Epilepsia， 2012，53(9)：41-58.

2 Kiryushko D，Berezin V，Bock E.Regulators of neurite outgrowth：role of cell adhesion molecules[J]. Ann N Y Acad Sci，2004，1014：140-154.

3 馬美剛，吳原，蘇婕，等. 難治性癲癇細胞模型中Lamininβ1的表達及意義[J].中風與神經疾病雜志，2010，27(10)：886-889.

4 蘇婕，吳原，吳月娟，等. 體外培養癲癇細胞模型中整合素α2表達的變化[J].中國神經精神疾病雜志 ，2011，37(8)：482-485.

5 Berti C，Bartesaghi L，Ghidinelli M，et al. Non-redundant function of dystroglycan and β1 integrins in radial sorting of axons[J]. Development，2011，138(18)：4025-4037.

6 Lee I，Guo HB，Kamar M，et al. N-acetylglucosaminyltranferase VB expression enhances beta1 integrin-dependent PC12 neurite outgrowth on laminin and collagen[J]. J Neurochem，2006，97(4)：947-956.

7 馬美剛，吳原，劉秀穎，等. 海馬神經元癲癇細胞模型的建立及乳酸脫氫酶變化的研究[C].中華醫學會第十三次全國神經病學學術會議論文匯編，2010.

8 趙文元，劉建民，盧亦成，等. 體外培養海馬神經元癲癇樣放電后的丟失方式[J]. 中華醫學雜志，2002，82(23)：1629-1631.