江西漢族人群NRG3基因rs17101655 T→G單核苷酸多態性與ITP的關聯性研究

李麗華,徐顏美,李靜,黃波,劉靜,章海斌,陳鑫,陳希敏,林晉,黃林鳳,王小中

(1、深圳市寶安婦幼保健院檢驗科,廣東深圳518133;2、南昌大學第二附屬醫院檢驗科,江西南昌330006;3、南昌大學第一附屬醫院檢驗科,江西南昌330006)

.論著.

江西漢族人群NRG3基因rs17101655 T→G單核苷酸多態性與ITP的關聯性研究

李麗華1,2*,徐顏美2*,李靜3,黃波2,劉靜2,章海斌2,陳鑫2,陳希敏2,林晉2,黃林鳳2,王小中2

(1、深圳市寶安婦幼保健院檢驗科,廣東深圳518133;2、南昌大學第二附屬醫院檢驗科,江西南昌330006;3、南昌大學第一附屬醫院檢驗科,江西南昌330006)

目的運用TaqMan探針法對NRG3基因rs17101655 T→G單核苷酸多態性進行基因分型,探討rs17101655 T→G單核苷酸多態性與原發免疫性血小板減少癥(ITP)的關聯性,為該病的發病機制提供重要線索.方法針對NRG3基因rs17101655位點T→G多態性,設計1對PCR引物和TaqMan探針,通過實時熒光PCR擴增進行基因分型;采用病例-對照研究,對中國漢族江西地區200例ITP和200例健康對照人群進行基因分型,比較兩組人群基因型分布及頻率差異.結果Rs17101655位點T→G多態性的基因型和等位基因頻率分布在ITP病例組和對照組中分布差異無統計學意義(P>0.05).結論TaqMan探針法可快速、高效地對單核苷酸多態性進行基因分型,本研究結果顯示NRG3基因rs17101655位點不作為中國漢族人群ITP的易感位點.

原發免疫性血小板減少癥;TaqMan探針;單核苷酸多態性

原發免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia,ITP)是一種獲得性自身免疫性疾病,成人發病率為5~10/10萬左右,該病的高發人群為育齡期女性及60歲以上老年人[1].主要臨床表現為全身皮膚黏膜或內臟出血,嚴重者可出現顱內出血[2].近年來,遺傳易感性在ITP的發病機制中的作用備受關注.研究者采用候選基因法已發現多種ITP的易感基因[3],但這些基因遠遠不足以解釋ITP發病的遺傳機制.最新研究排除飲食、藥物等多種血小板計數干擾因素后,發現NRG3基因與血小板計數顯著相關[4].考慮到ITP疾病主要由于血小板計數極度減低而出現一系列的臨床癥狀,因此本研究推測影響血小板計數變化的基因可能在ITP的發病機制中也發揮不可忽視的作用.為證實這一想法,本研究采用TaqMan探針技術初步探討NGR3基因rs17101655 T→G多態性與ITP的關聯.

1 材料與方法

1.1 一般資料按《成人原發免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識》診斷標準[5]收集確診的ITP患者200例,以及與病例組年齡,種族,性別相匹配的健康體檢者200例,分別收取2ml EDTA抗凝靜脈血.病例組樣本來自于南昌大學第二附屬醫院2011年1月至2013年6月期間的住院和門診ITP患者,均為中國漢族人,無親屬關系及排除遺傳病史者.其中男性65例,女性135例,男:女=1: 2.1.所有樣本均來自江西地區,個體間無地域差異性.

1.2 儀器與試劑ViiA7實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司),Theromo NanoDrop 2000C紫外/可見分光光度定量儀(中國賽默飛世爾科技有限公司), LX-100手掌型離心機(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司).

血液基因組柱式提取試劑盒(德國Qiagen公司), TaqMan SNP Genotyping Assays(美國Life Technologies),TaqManR Genotyping Master Mix(美國Life Technologies),ddH2O(本實驗室自備的無菌水).

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取、檢測及稀釋采用天根血液基因組柱式提取試劑盒嚴格按說明書操作提取抗凝靜脈血中的全基因組DNA,通過Theromo NanoDrop 2000C紫外/可見分光光度定量儀器進行DNA定量檢測,記錄DNA純度和濃度值.以純度OD260/280位于1.8~2.0為合格樣本.并用ddH2O將DNA母液定量稀釋至15μl終濃度為20ng/μl工作液,用于后續TaqMan分型檢測.

1.3.2 TaqMan探針和引物設計針對rs17101655 T→G位點所設計的兩條探針分別用VIC和FAM進行熒光標記,由美國ABI Life technology公司設計并合成,探針及引物貯存液為40倍濃縮液(40X TaqMan SNP Genotyping Assay Mix).ABI公司合成rs17101655 T→G探針試劑編號(Assay ID)為AHD19QU.

1.3.3 rs17101655 T→G分型PCR總反應體系為10μl,包括(2XTaqMan Genotyping Master Mix)5μl、引物與探針混合液(40XTaqMan SNP Genotyping Assay Mix)0.25μl、模板DNA(20ng/μl)1μl、ddH2O 3.25μl.每96孔板設置1個空白對照.反應程序為pre-read stage 60℃,30s;hold stage:95℃,10min;反應條件為95℃,15s,60℃1min,60℃30s,共40個循環;post-read stage 60℃1min.反應在ViiA7實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進行,利用TaqMan Genotyper軟件自動基因分型.

1.3.4 基因分型結果判定Life technology公司采用VIC和FAM熒光素標記rs17101655位點的G和T等位基因.當樣本基因型為純合子GG時, PCR擴增曲線顯示VIC熒光信號值遠遠高于FAM熒光信號值;當樣本基因型為純合子TT時,PCR擴增曲線顯示FAM熒光信號值遠遠高于VIC熒光信號值;當樣本基因型為雜合子TG時,PCR擴增曲線顯示FAM熒光信號值約等于VIC熒光信號值.

1.4 統計分析采用基因計數法計算SNP多態位點的等位基因頻率和基因型頻率,以擬合優度χ2檢驗分析基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡定律.采用比值比(odds ratio,OR)和95%置信區間(95%confidence interval,CI)分析基因多態性與ITP的關聯強度.P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗病例組和對照組人群rs17101655 T→G位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),表明本研究人群來自遺傳平衡的群體,見表1.

表1 基因型頻數分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.2 rs17101655位點等位基因的TaqMan分型結果rs17101655位點具有T和G兩種等位基因,共TT、TG和GG 3種基因型.本實驗分型結果顯示ITP組TT型187例,TG型12例,GG型1例;對照組TT型194例,TG型6例,GG型0例(見圖1),該結果與人類基因組計劃(HapMap)公布的中國北京人的SNP分型數據相一致.

2.3 rs17101655位點基因型頻率和等位基因頻率與中國漢族江西地區ITP的關系ITP病例組rs17101655位點TT、TG和GG基因型頻率分別為93.5%、6%和0.5%,對照組的基因型頻率分別為97.0%、3.0%和0.0%.rs17101655位點與ITP疾病的發生存在一定的風險(OR=2.07,95%CI=0.76~ 5.64),但該位點的基因型頻率在兩組間比較,差異無統計學意義(χ2=2.13,P=0.34)(見表2).等位基因T在ITP病例組和對照組中的頻率分別為96.5%和98.5%,等位基因G在ITP病例組和對照組中的頻率分別為3.5%和1.5%.G等位基因為風險等位基因(OR=2.38,95%CI=1.19~4.75).兩組人群間等位基因頻率差異無統計學意義(χ2=2.51,P=0.11)見表3.

圖1 TaqMan技術分型rs17101655位點等位基因的結果

表2 rs17101655位點基因型頻率分布及其與ITP的關系

表3 rs17101655位點等位基因頻率分布及其與ITP的關系

3 討論

為深入理解ITP的遺傳機制,研究者紛紛采用候選基因法發現63種ITP的易感基因,主要集中于細胞因子、Fc受體、DNA甲基化和HLA等方面[6].但這些基因不足以充分解釋ITP的發病機制.研究者對75例健康兒童,排除多種干擾因素后,發現神經調節蛋白3(NRG3)基因與血小板計數顯著相關[4],但其具體的作用機制仍然不清.考慮到ITP主要由于血小板計數極度減低而出現一系列的臨床癥狀,因此本研究推測影響血小板計數的基因可能在ITP的發病過程中起重要作用.因此本研究采用病例-對照研究方案,通過TaqMan探針技術對江西地區部分ITP患者進行NRG3基因rs17101655 T→G單核苷酸多態性的關聯性研究.

目前,國內外尚無ITP疾病與NRG3基因rs17101655 T→G位點的關聯性研究報道,本研究為首次對ITP與NRG3基因的關聯性研究.結果顯示ITP病例組rs17101655位點TG基因型頻率(6.0%)高于對照組(3.0%),但rs17101655位點的基因型頻率及等位基因頻率在兩組間的差異無統計學意義(P>0.05).本研究結果表明rs17101655 T→G位點與ITP的發病無潛在關聯.由于樣本量小,研究對象和地域局限,其結果代表性不強,因此需要更多的大規模病例對照研究來進一步證實該位點與ITP的關聯性.另外,NRG3基因可能在正常生理情況下控制血小板計數,而在ITP這種病理環境下并不起控制血小板計數的主導作用.

此外,本研究進一步證實TaqMan探針法能高效準確地進行單核苷酸多態性分型,具有操作簡便、省時、省力等優點.鑒于探針與引物混合液對外界DNA極其敏感,易受空氣中氣溶膠等的影響,因此在TaqMan探針法實驗實際操作過程中應嚴格在超凈工作臺內進行,且操作前應對移液槍等器材進行紫外線消毒,以避免外界DNA混入PCR反應體系中,而導致分型錯誤.

[1]Deane S,Teuber SS,Gershwin ME.The geoepidemiology of immune thrombocytopenic purpura[J].Autoimmunity Rev,2010,9(5): 342-349.

[2]Stasi R,Newland AC.ITP:a historical perspective[J].Br J Haematol,2011,153(4):437-450.

[3]Bergmann AK,Grace RF,Neufeld EJ.Genetic studies in pediatric ITP:outlook,feasibility,and requirements[J].Ann Hematol, 2010,89:95-103.

[4]Guerrero JA,Rivera J,Quiroga T,et al.Novel loci involved in platelet function and platelet count identified by a genome-wide study performed in children[J].Haematologica,2011,96(9):1335-1343.

[5]侯明,秦平.成人原發免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識(修訂版)[J].中華血液學雜志,2011,32(3):214-216.

[6]徐顏美,鄧立彬,王小中.原發免疫性血小板減少性紫癜的遺傳學研究進展[J].重慶醫學,2014,43(13):2544-2546.

A study of the correlation between NRG3 gene rs17101655 T→G single nucleotide polymorphism and ITP in Han popu-lation of Jiangxi

LI Lihua,XU Yanmei,LI Jing,et al.Department of Clinical Laboratory,the Maternity and Child Health Care Hospital of Baoan District in Shenzhen,Shenzhen Guangdong 518133,China

ObjectiveTo explore the correlation between NRG3 rs17101655 T→G single nucleotide polymorphism and primary immune thrombocytopenic purpura(ITP)with the TaqMan probe technology,and provide novel important clues for understanding the pathogenic mechanism of ITP.MethodsA case-control study was applied to detect rs17101655 T→G polymorphism, a total of 200 ITP patients and 200 controls were enrolled from the Han population of Jiangxi region in China.One pair of special TaqMan probe and PCR primers for NRG3 rs17101655 T→G single nucleotide polymorphism was designed,and the genotyping was conducted by real-time PCR.Then the difference of genotype distribution and allele frequency between the two groups was compared.ResultsThe genotype distribution and allele frequency of rs17101655 T→G polymorphism between cases and controls have not significantly statistical difference(P>0.05).ConclusionsThe TaqMan probe method can rapidly and efficiently genotyping for single nucleotide polymorphisms.Our results showed that NRG3 gene rs17101655 polymorphism cannot be a susceptibility locus for ITP in the Han population of Jiangxi.

Primary immune thrombocytopenic purpura;TaqMan probe;Single nucleotide polymorphism

R558+.2

A

1674-1129(2014)03-0237-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.002

2014-02-20;

2014-02-27)

江西省教育廳課題基金資助項目(No:GJJ13157);江西省研究生創新專項基金資助金項目(No:YC2012-S027).作者簡介:李麗華,女,1978年出生,在職研究生,研究方向:血小板疾病及診斷.

徐顏美,女,1989年出生,南昌大學在讀研究生,研究方向為血液病遺傳學*(共同第一作者).

王小中,男,1973年生,博士生導師.