小檗堿對外科術后產AmpC酶分離菌株的抑菌作用

徐劍,司徒瑞儒,林勇平

(1、廣州市海珠區婦幼保健院外科,廣東廣州510220;2、廣州市海珠區第一人民醫院檢驗科,廣東廣州510220;3、廣州醫學院第一附屬醫院檢驗科,廣東廣州510120)

小檗堿對外科術后產AmpC酶分離菌株的抑菌作用

徐劍1,司徒瑞儒2,林勇平3

(1、廣州市海珠區婦幼保健院外科,廣東廣州510220;2、廣州市海珠區第一人民醫院檢驗科,廣東廣州510220;3、廣州醫學院第一附屬醫院檢驗科,廣東廣州510120)

目的了解外科術后感染的病原菌分布情況并探討小檗堿對產AmpC酶術后感染分離菌株的抗菌作用.方法從術后感染病人中分離出產AmpC酶細菌,并采用瓊脂對倍稀釋法、肉湯稀釋法分別檢測小檗堿對產AmpC酶三種分離菌株的最低抑菌作用.結果共分離出G-桿菌225株,其中產AmpC酶大腸埃希菌46株,有27株MIC為濃度31.25g/l小檗堿;高產AmpC酶肺炎克雷伯菌有26株,有13株MIC為濃度31.25g/l小檗堿;產AmpC銅綠假單胞菌21株,有12株MIC為濃度60.25g/l小檗堿.濃度為15.62g/L小檗堿對產AmpC酶分離菌基本上無抑制作用.G+的病原菌有170株,其中金黃色葡萄球菌94例,表皮葡萄球菌36例,真菌27例.結論產AmpC酶的G-桿菌在術后感染中較為常見,而小檗堿對產AmpC酶細菌株有一定的抑菌作用,值得臨床上推廣應用,以減少濫用抗生素而引起多重耐藥的產生.

術后感染;小檗堿;產AmpC酶;抗菌作用

近年來,隨著醫療技術的發展和新的抗生素出現,特別是β-內酰胺類抗生素的推廣和濫用,術后切口感染率有不斷上升的趨勢,病原菌的耐藥性也日益增高.第三代頭孢菌素的廣泛應用,產AmpC酶細菌感染也日益嚴重.這會延長患者的住院時間,增加治療費用,甚至還可能導至治療失敗.產AmpC酶細菌的感染,已給術后治療帶來了新的挑戰.AmpC酶是由G-桿菌產生,由染色體或質粒介導的一類β-內酰胺酶.β-內酰胺酶按分子結構分類法可分為C類和Bush Jacoby Medeiros類,C類作用于頭孢菌素、且不被克拉維酸所抑制的β內酰胺酶.而且還易引起耐藥性的漫延[1].在我國,中藥資源豐富,價格低廉,如果能從中草藥中開發出純天然抗生素對術后感染病人的治療有著重要的意義.小檗堿是黃連、黃柏及三黃湯等中藥的主要活性成分,是一種常用的屬異喹啉類生物堿,其價格低廉,具有廣譜抗菌作用[2].而質粒介導的超廣譜β-內酰胺酶及染色體突變去阻遏持續高產AmpC酶是導致細菌對第三代頭孢菌素耐藥的兩類最重要的酶.如果能從中草藥中找出抑制這二種酶的中草藥,充分利用我國的中草藥資源,生產出新型抗菌藥物,為臨床上治療產AmpC酶細菌所引起的感染提供新的手段.對我國醫療事業的發展具有重要的意義.本文通過分析手術切口感染菌的分布情況,并用小檗堿對產AmpC酶分離菌株進行抑菌作用試驗,探討小檗堿對產AmpC酶菌株的抑菌作用.

1 材料與方法

1.1 材料所有的檢測菌株均來自我院和廣州醫學院第一附屬醫院2010年1月至2012年12月的外科術后傷口感染非重復分離菌株,其中G-桿菌225株,G+球菌170株,用常規方法分離培養,鑒定,并通過AmpC酶檢測確定產AmpC酶大腸埃希菌46株,高產AmpC酶肺炎克雷伯菌26株,產AmpC酶銅綠假單胞菌21株.

1.2 方法嚴格按照CLSI推薦方法對切口感染病原菌分離培養,并用珠海迪爾的微生物鑒定儀對分離菌鑒定.

1.3 AmpC酶檢測大腸埃希菌和銅綠假單胞菌AmpC酶檢測采用FOX紙片的耐藥性測定,均嚴格按照CLSI推薦的方法進行.持續高產AmpC酶細菌檢測采用三維酶粗提法檢測.

1.4 MIC測定方法用瓊脂稀釋法配制出含小檗堿濃度為500g/L、250g/L、125g/L、62.5g/L、31.25g/L和15.6g/L的MH平板,并另用不含中藥的MH平板作為對照.將分純后的目標菌株35℃培養18h后,配制成濃度約為1.5X107個/ml菌夜,再用定量環接種在含不同濃度小檗堿的平板上,檢測最小抑菌濃度.

1.5 儀器和材料實驗儀器主為珠海迪爾DL-96微生物檢測儀,藥敏紙片購自英國Oxoid公司,鑒定試劑由珠海迪爾公司提供,MH、血培養基購自江門凱林公司,小檗堿由中國藥品生物制品檢定所提供.

2 結果

2.1 傷口感染菌群分情況共檢查出G-病原菌225例,其中大腸埃希菌93例,肺炎克雷伯菌68例,銅綠假單胞菌43例,產AmpC酶的大腸埃希菌,高產AmpC酶肺炎克雷伯菌,產AmpC銅綠假單胞菌分別46例,36例,21例.G+病原菌170例,其中金黃色葡萄球菌94例,表皮葡萄球菌36例,真菌27例.

2.2 小檗堿對產AmpC酶細菌的MIC情況經35℃培養18h后,選擇比例較高的前三種細菌菌株在含不同濃度的小檗堿平板上培養,結果如表2.濃度為250g/L,125g/L,62.5g/L,31.25g/L的小檗堿對3種目標菌株都有不同的抑制作用,27例產AmpC酶大腸埃希菌MIC為濃度是31.25/L小檗堿,13例高產AmpC酶肺炎克雷伯菌的MIC為而濃度31.25/L小檗堿,12例產AmpC酶銅綠假單胞菌MIC為62.5/L小檗堿.濃度為15.62g/L的小檗堿基本對產AmpC酶細菌無抑制作用.

表1 傷口感染菌群分布情況

表2 小檗堿對產AmpC酶細菌的MIC結果

3 討論

隨著現代醫療技術的發展,各類手術治療數量不斷增多,術后切口感染也成了外科遇到的棘手問題之一,同時,由于抗生素的大量開發和術前過度性預防用藥,導致了病人免疫功能紊亂和體內正常菌群失調,使手術患者者傷口感染率大大增加.在感染率增加的同時,細菌的耐藥性也大幅提高.特別是β-內酰胺類抗生素的出現和濫用,增加了細菌β-內酰胺酶的產生和蔓延.β-內酰胺酶的產生,使單靶位作用的抗生素的療效顯著下降,在增加用藥劑量的同時,增加了毒副作用,給外科手術治療疾病帶來了嚴重的威脅.由于受患者自身免疫狀態、住院時間長短、手術創傷面大小、醫院環境衛生條件及護理質量等原因的影響,近年來術后病人傷口感染的細菌種類也不斷變化.表1顯示,在本文研究的菌群分布中,G-桿茵占比例較大,主要是以大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌為主,其中有48%的G-桿茵產生AmpC酶.

AmpC酶主要是由革蘭陰性桿菌產生的一類β-內酰胺酶,是由細菌的染色體介導而產生,由位于染色體上的ampR,ampD,ampE和ampG等基因調控,并由ampC基因轉錄合成[3].AmpC酶主要可分為質粒型,誘導型和去阻遏突變型.質粒介導的AmpC酶經常在大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌、產氣腸桿菌和奇異變形桿菌中持續高水平表達[4].細菌的AmpC酶耐藥基因可以在質粒間及質粒與染色體間轉移,也可通過轉化、接合等方式轉移給其他細菌,從而造成耐藥性的傳播.

有研究表明,無論單產AmpC酶還是單產ESBLs的菌株,對三代頭孢菌素都表現出高度的耐藥[5],而且,隨著近年來我國抗生素的廣泛使用,這種耐藥性的傳播也日益嚴重[6].因此尋找一種譜廣抗菌,耐藥率低,價格低廉的抗生素成為目前醫學界當務之急.應用了兩千多年的中藥小檗堿,是從中藥黃連、黃柏等植物中提取出來的異喹啉生物堿.其藥理作用廣泛,在臨床上常用于抗腸道細菌感染疾病和清熱解毒.它可作用于細菌(如大腸埃希菌:E.coli)的多個位點,未見導致明顯的抗藥性[7],而且具有價廉、易得、低毒等優點.它還具有抑制腫瘤轉移、降低血糖和改善心腦血管功能等藥效.

本研究的225株傷口感染細菌中,主要是以腸埃希菌和肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌為主,菌群的分布情況見表1.結果與國內的一些研究有一定的差異[6],這與目前抗生素濫用及其他原因而導致菌群的變化有關.從表2結果可以看出,產AmpC酶大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌的MIC分別是31.25g/L、62.5g/、62.5g/L的菌株最多.由此可見,不同濃度的小檗堿對產AmpC酶細菌都具有一定的抑制作用.另外,有報道小檗堿除了具有抗菌作用外,不易產生耐藥性,副作用小等優點,還可以通過調節機體的免疫系統和改善機體微循環,從而達到清除病原菌的作用[8].有研究表明,如果小檗堿能與其他抗生素聯合使用,效果更佳[9].因此,小檗堿應不失為目前臨床上的一種治療術后感染性疾病和防止細菌產生耐藥性的一種良好藥物.

[1]鄧連瑞.2011、2012兩年臨床常見病原菌分布及耐藥性分析[J].實驗與檢驗醫學,2013,31(6):639-641.

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[3]劉丹,劉曉峰,郎梅春,等.大腸埃希菌生物被膜形成能力及超廣譜β-內酰胺酶檢測[J].實驗與檢驗醫學,2012,2(30):140-143.

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Inhibitory effects of berberine on postoperative AmpC enzyme producing strains

XU Jian,SITU Ruiru,LIN Yongping.The Maternal and Child Health Hospital of Haizhu District,Guangzhou 510220,China

ObjectiveTo investigate the pathogenic bacteria distribution in postoperative infection and the effects of berberine on the antibacterial effect of AmpC enzyme producing strains.MethodsThe bacteria producing AmpC enzyme were isolated from patients with postoperative infection,and the minimum inhibitory effects of berberine on the three kinds of isolates producing AmpC enzymes were detected by using the agar dilution method and broth dilution method.ResultsA total of 225 strains of G-Bacillus were isolated,46 strains of which producing AmpC enzyme,the MIC of 27 strains was 31.25g/L berberine; 26 strains of Klebsiella pneumoniae producing high AmpC,13 of which had MIC concentration of 31.25g/L berberine;21 strains of Pseudomonas aeruginosa producing AmpC,12 strains of which had MIC concentration of 60.25g/L berberine.The concentration of 15.62g/L berberine had no inhibitory effect on bacteria producing AmpC enzyme.There were 170 strains of G+pathogen,including 94 cases of Staphylococcus aureus,36 cases of Staphylococcus epidermidis and 27 cases of fungus.ConclusionG-coli producing AmpC enzyme in postoperative infections are more common,and the berberine has some antibacterial effect on bacterial strains producing AmpC enzyme.In order to reduce the abuse of antibiotics and cause multiple drug resistance,it is worthy of clinical application.

Postoperative infection;Berberine;AmpC enzyme;Antibacterial effect

R446.5,Q939.92

A

1674-1129(2014)03-0243-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.004

2013-10-25;

2014-04-17)

廣東省科技廳社會發展領域科技計劃項目(編號: 20120318025);廣州市衛生局資助項目(編號:2009-BY-40)

徐劍,男,1971年11月出生,副主任醫師,碩士研究生學歷,主要從事外科學和感染性疾病的研究.

司徒瑞儒,男,1972年3月出生,主任技師,學士學位,主要從事臨床檢驗工作.