CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+檢測在急性髓系白血病中的應用

吳瓊,李潔,方江春,賀文鳳

(1、南昌大學第二附屬醫(yī)院江西省分子醫(yī)學重點實驗室,江西南昌330006;2、萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院血液科,江西萍鄉(xiāng)337055)

CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+檢測在急性髓系白血病中的應用

吳瓊1,李潔1,方江春2,賀文鳳1

(1、南昌大學第二附屬醫(yī)院江西省分子醫(yī)學重點實驗室,江西南昌330006;2、萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院血液科,江西萍鄉(xiāng)337055)

目的探討CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+檢測與急性髓系白血病的發(fā)病機制、治療效果及預后的關系,并與CD4+CD25+/CD4+法比較兩種檢測方法是否存在差異.方法應用流式細胞術法分別檢測41例初治AML患者(初治組)、11例一次化療緩解的患者(化療敏感組)、9例兩次以上化療不緩解的患者(化療耐藥組)、13例化療緩解后一直沒有復發(fā)的患者(持續(xù)緩解組)、8例化療緩解后又再次復發(fā)的患者(復發(fā)組)和20例健康體檢者(對照組)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+及CD4+CD25+/ CD4+在外周血中的比例.結果與對照組相比較,AML患者初治組兩類細胞比例均較正常人明顯升高(P<0.01),初治患者組兩種檢測方法間存在顯著差異(P<0.01).與化療緩解組比較,化療耐藥組兩種檢測方法檢測的比例均明顯升高(P<0.01),耐藥患者組兩種方法間存在顯著差異(P<0.01).與持續(xù)緩解組比較,復發(fā)組患者的比例明顯升高(P<0.01),復發(fā)組兩種方法間存在顯著差異(P<0.01).結論急性髓系白血病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+與急性髓系白血病的發(fā)生相關,并且檢測其比例能預測白血病患者對化療藥物的反應及預后,且其靈敏度高于CD4+CD25+/CD4+檢測法,而其特異性與CD4+Foxp3+/CD4+檢測法一致.

CD4+CD25+Foxp3調節(jié)性T細胞;急性髓系白血病;流式細胞術

急性白血病是一類造血干細胞異常的克隆性惡性疾病,目前對于急性白血病的治療最有效的手段是造血干細胞移植,然而由于供者來源的局限性、手術費用高等因素使得免疫治療逐漸成為了治療腫瘤的新手段.調節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)是一種重要的免疫調節(jié)細胞與血液腫瘤的發(fā)生有著密切聯(lián)系,以往研究將CD4+CD25+Treg細胞作為腫瘤免疫機制研究的主要對象,然而由于CD25并不是Treg的獨特標志,使得有關CD4+CD25+Treg細胞的研究存在矛盾的結果.本研究通過流式細胞儀檢測比較了正常人、急性髓系白血病初治者、緩解者及復發(fā)者外周血CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+在外周血中的比例,并與CD4+CD25+/CD4+法進行比較,從而探討CD4+CD25+Foxp3+與急性白血病的發(fā)病機制、治療效果及預后的關系,探討兩者間更為敏感和特異的檢測方法,為急性白血病的發(fā)病機制及免疫治療提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究對象選取南昌大學第二附屬醫(yī)院血液科2009年2月-2011年12月所有急性髓系白血病住院患者,總共41例,男性24例,女性17例,平均年齡45歲.所有急性白血病患者均經過臨床、骨髓細胞學、染色體、白血病免疫分型確診.依據(jù)FAB分型M3 15例,M2 17例,M4 3例,M16例.將上述初治病人經一次化療緩解的患者作為化療敏感組,總共11例;經兩次以上化療不緩解的患者作為化療耐藥組,總共9例;經一次化療緩解后不再復發(fā)的患者作為持續(xù)緩解組,總共13例;經化療緩解后又再次復發(fā)的患者作為復發(fā)組,總共8例.診斷及療效均符合鄧家棟編著的《臨床血液病學診斷標準》之國內診療標準.正常對照組來自我院體檢中心,其中男性11例,女性9例,平均年齡32歲.

1.2 主要試劑和儀器用于Treg細胞檢測的熒光抗體:PE標記的鼠抗人IgG抗體、FITC標記的抗人CD4、APC標記的抗人CD25、PE標記的抗人Foxp3抗體以及10X的破膜劑和溶血素,以上試劑均來自美國BD公司;流式細胞儀為美國BD公司Fascalibur型四色流式細胞儀;移液器為美國eppendorf公司;臺式離心機為上海飛鴿牌TDL-5-A型.

1.3 Treg細胞檢測采集外周血2ml加入EDTA抗凝管,充分混勻;準備兩根流式管,標明同型對照管和檢測管,分別以1、2表示;取外周血100ul分別加入兩管,1、2管都加入CD4-FITC/CD25-APC各20μl,暗室室溫避光孵育20~30min;避光孵育后加入稀釋的溶血素和破膜劑,反應后以破膜緩沖液洗滌并重懸,1管加入IgG-PE 5μl,2管加入Foxp3-PE 20μl,暗室室溫避光孵育20~ 30min;加入5ml PBS緩沖液洗滌,1200r/min離心5min去上清.加入400μlPBS緩沖液上機檢測.用FSC/SSC參數(shù)先找到淋巴細胞群,找到CD4+CD25+雙陽細胞群,IgG-PE為同型對照,使用對照管調整補償和電壓,使得陰性細胞群位于點圖的左下角,收集至少10000個細胞,以CD4+CD25+雙陽細胞射門,分析Foxp3的百分率,在計算機上用Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù),減去陰性對照管的非特異性對照值.

1.4 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s),P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 正常人和急性白血病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達20例對照組外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+細胞比例為(1.05±0.10)%,CD4+CD25+/CD4+細胞比例為(0.98± 0.07)%,兩者間無統(tǒng)計學差異(P>0.05).41例初治組的比例分別為(49.37±2.08)%及(5.56±0.38)%,兩者間有統(tǒng)計學差異(P<0.01),初治患者CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+均高于正常人,具有統(tǒng)計學差異(P<0.01).見表1.

表1 正常人、急性白血病初治患者外周血Foxp3+的表達

2.2 化療耐藥和化療敏感患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達9例化療耐藥組外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+細胞比例為(47.97±0.91)%,CD4+CD25+/CD4+細胞比例為(6.87± 0.58)%,兩種方法具有統(tǒng)計學差異(P<0.01).11例化療敏感組的比例分別為(0.91±0.07)%及(0.85±0.05)%,兩種方法間無統(tǒng)計學差異(P>0.05).化療耐藥組患者CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+細胞比例及CD4+CD25+/CD4+細胞比例均高于化療敏感組患者,兩組間具有統(tǒng)計學差異(P<0.01).見表2.

表2 化療耐藥組、化療敏感組患者外周血Foxp3+的表達

2.3 持續(xù)緩解患者和復發(fā)患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的表達13例持續(xù)緩解組外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+細胞占CD4+CD25+/CD4+細胞比例分別為(1.67±0.06)%和(1.52± 0.12)%,兩者間無統(tǒng)計學差異(P>0.05).8例復發(fā)組比例分別為(50.50±1.46)%及(6.58±0.59)%,兩者間有統(tǒng)計學差異(P<0.01),復發(fā)患者CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+均高于持續(xù)緩解者,具有統(tǒng)計學差異(P<0.01).見表3.

表3 持續(xù)緩解組、復發(fā)組患者外周血Foxp3+的表達

3 討論

Treg是CD4+T細胞的一種獨特的亞型,是一類具有免疫無反應性和免疫抑制性的T細胞亞群,具有主動調控或抑制其他免疫活性細胞的功能,在免疫反應中起到關鍵性的作用.以往研究認為白介素-2(IL-2)受體α鏈(CD25)是Treg細胞的特異標志,并將CD4+CD25+作為研究Treg的標志.目前有關CD4+CD25+與腫瘤的關系已經有了大量的研究,在胃癌、乳腺癌、肝癌等多種實體瘤患者的外周血和腫瘤局部,CD4+CD25+Treg的數(shù)量都比正常人明顯增高[1-3].Beyer等[4]對3例慢性淋巴細胞白血病患者和42例正常人外周血進行分析,發(fā)現(xiàn)CTLA4+、Foxp3、GITR、TGF-β1、CD62L+、IL-10在慢性淋巴細胞白血病初治患者中的表達較正常人明顯升高.慢性淋巴細胞白血病患者在使用氟達拉濱連續(xù)化療后,外周血中的Tregs相應下調,并且出現(xiàn)了抑制功能的減弱,甚至消失.Beyer等[4-5]對急性髓系白血病患者的CD4+CD25+Treg細胞進行研究,發(fā)現(xiàn)患者組CD4+CD25+Treg細胞占外周血CD4+T細胞中的比例較正常對照組明顯增高,而且與患者的病程、疾病的預后明顯相關,提示腫瘤患者血清中可能存在某種能夠促進CD4+CD25+Treg細胞生成的物質,使之具有天然的免疫反應,并具有促進機體免疫抑制的作用.然而,腫瘤抗原特異的免疫治療效果目前并不令人十分滿意,有關CD4+CD25+Treg細胞的研究結果也存在一定的不一致性,研究者們開始考慮這種結果的不一致是否與CD4+CD25+不能特異性的代表Treg細胞有關[6].

Foxp3屬于foxhead家族分叉頭/翼狀螺旋轉錄調節(jié)因子,是細胞獲得免疫調節(jié)特性的關鍵轉錄因子,目前認為Foxp3是Treg細胞的特異標志,其表達正常是CD4+CD25+Treg發(fā)揮作用的前提[7]. Rudemky[8]等研究證明Foxp3在調節(jié)性T細胞特異性表達,有著調控Tregs的發(fā)育及功能的作用. Shenghui Z[9]等利用多色流式細胞術在外周血和骨髓中檢測CD127、CD4和CD25來鑒定出Foxp3+Treg,研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+CD127lowTreg頻率顯著增加,并且在初治的AML病人的外周血中它們的表型是不同于健康志愿者,當AML治療完全緩解后Treg頻率下降了,當AML復發(fā)后Treg頻率又上升了.在完全緩解的病人診斷時期外周血和骨髓的Treg頻率要低于持續(xù)不能緩解的病人.目前有關CD4+CD25+Foxp3+與急性白血病發(fā)病機制、預后等方面的研究還未見報道.

本研究通過流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)初治患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的比例高于正常對照;耐藥組患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的比例高于化療敏感組;復發(fā)組患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的比例高于持續(xù)緩解組;初治患者組、耐藥組及復發(fā)組兩種檢測方法存在顯著差異, CD4+CD25+/CD4+結果與以往報道相似[10],CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+檢測法與對照的差異顯著高于CD4+CD25+/CD4+檢測法.

通過本研究提示急性白血病患者體內CD4+CD25+Foxp3+細胞增高可能導致了白血病細胞逃避免疫清除,抑制了機體免疫系統(tǒng)對白血病細胞的有效攻擊,使白血病細胞產生免疫逃逸,從而導致白血病的發(fā)生.CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的比例增高可能提示患者對化療藥物反應差,患者很難達到緩解,CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞數(shù)量有可能是預測患者對藥物療效的重要指標之一.CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的數(shù)量可能是引起急性白血病的復發(fā)的原因之一,并有可能作為一項提示疾病復發(fā)的指標.檢測CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+檢測法可能比以往報道的檢測CD4+CD25+/CD4+的方法更敏感,而特異性一致.因此,CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的檢測可能能更好的作為預測患者療效、監(jiān)測疾病復發(fā)和判斷預后的一個指標.

CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞是急性白血病患者免疫抑制并導致腫瘤免疫逃逸的一個重要原因之一,下調Treg細胞數(shù)量或功能有可能提高患者抗腫瘤免疫效應,這為以Treg為靶標的免疫調控治療策略提供有益的啟示,為臨床最終治愈AML患者提供新的策略.

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The application of detecting CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+Tregs in acute leukemia

ObjectiveTo explore the significance of CD4+CD25+Foxp3+Tregs detection in the pathogenesis,curative effect and prognosis of acute leukemia,and compare it with the method of CD4+CD25+/CD4+detection and determine whether there is difference between the two methods.MethodsThe proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in the peripheral blood were tested in 41 cases of untreated patients with AML(Initial treatment group),11 cases of remission-patients after one period of chemotherapy (Chemotherapy sensitive group),9 cases of non-remission-patients after two period of chemotherapy(Chemotherapy resistance group),13 cases of recurrence-free-patients achieving chemotherapy remission(Sustained remission group),8 relapsed patients achieving Chemotherapy remission(Relapse group),20 cases of healthy donators(control group)by using flow cytometry,and the proportion of CD4+CD25+Foxp+Tregs cells in the peripheral blood with the method of CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+were detected.ResultsThe proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in the peripheral blood of initial treatment group was greatly higher than that of control group,but there was no difference between the two methods of CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+detection.The proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in the peripheral blood of chemotherapy resistance group was greatly higher than that of chemotherapy sensitive group,but there was no difference between the two methods of CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+detection in the chemotherapy resistance group and chemotherapy sensitive group.The proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in the peripheral blood of relapse group was greatly higher than that of sustained remission group,but there was no difference between the two methods of CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+and CD4+CD25+/ CD4+detection in the relapse group and sustained remission group.ConclusionsThe significant increased rate of CD4+CD25+Foxp3+Tregs cells in peripheral blood of AML patients may be related to the occurrence of leukemia and the detection of the proportion of CD4+CD25+Foxp3+Tregs can predict prognosis and response to chemotherapy in patients with leukemia.And its detection sensitivity is higher than that of the CD4+CD25+/CD4+detection method,but its specificity is consistant with the method ofCD4+Foxp3+/CD4+assay.

CD4+CD25+Foxp3+Tregs;Foxp3;Acute leukemia;Flow cytometry

R733.7,R446.62

A

1674-1129(2014)03-0246-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.005

2013-10-31;

2013-11-26)

江西省衛(wèi)生廳科技計劃(編號:20093049)

吳瓊,女,1984年出生,主管技師,醫(yī)學檢驗,研究方向流式細胞術.

李潔,女,1963出生,實驗師,研究方向為流式細胞術.

WU Qiong,LI Jie,FANG Jiangchun,etal.The Key Molecular Medical Laboratory of Jiangxi Province,the Second Affilicated Hospital of Nanchang University,Nanchang330006,China