糖化血紅蛋白五種檢測方法的評價

田偉,陳榕方,王毅,楊宏偉,方軍,賈治國

(1、天津市天津醫院檢驗科,天津300211;2、天津市泰達醫院檢驗科,天津300457)

.實驗研究.

糖化血紅蛋白五種檢測方法的評價

田偉1,陳榕方2,王毅1,楊宏偉1,方軍1,賈治國1

(1、天津市天津醫院檢驗科,天津300211;2、天津市泰達醫院檢驗科,天津300457)

目的將糖化血紅蛋白測定的電泳法、親和層析法、酶法和免疫法和HPLC法進行比較及評估,為臨床醫師及實驗室在分析不同方法檢測糖化血紅蛋白結果時提供參考.方法正常對照組45例,DM患者44例,每一份標本在同樣條件下用五種方法檢測HbA1c,記錄測定結果,用于對比分析;選擇具有醫學決定水平的正常和異常濃度的樣本,分別采用5個樣本,批內在同一天內重復20次;批間分別在7 d內進行10次測試.計算出批內和批間的均值、標準差和CV值;收集HbA1c高的糖尿病患者的抗凝血,同時收集當天健康者的抗凝血.在各種干擾物不同濃度的影響下,如果HbA1c的值上下浮動0.3%,則將視為受到干擾.采用SPSS16.0統計軟件包對所測結果進行配對t檢驗(以HPLC組的實驗數據為參照組),檢驗水準α=0.05.結果5種方法中除外硼酸親和法,其他四種方法均符合要求;5種方法在4.0%~14.2%范圍內線性良好,實測值與理論值的相關系數(r)在0.971~0.996之間,其中HPLC法最好;當加入各種干擾因素時,結果顯示HPLC法、酶法、膠乳凝集法測得的HbA1c值上下浮動<0.1%,可見性能穩定、不易受到各種干擾物的影響;電泳受溶血影響非常大;硼酸親和法對溶血標本顯示濃度太低時測不出數,脂血標本顯示濃度太高時測不出數;通過標本量、測定時間、CV、r等指標進行比較,HPLC法各種指標遠優于其他方法.結論高校液相色譜法(HPLC)作為金標準,批內和批間精密度在所采用的5種方法中是最好的,其次為酶法和膠乳凝集法,而硼酸親和法的重復性則相對較差.電泳法結果與實驗人員掃描和對電泳的波峰判斷有關,主觀隨意性較大,現將HPLC法和電泳法、親和層析法、酶法和免疫法進行比較,旨在為臨床醫師及檢驗科實驗室在分析不同方法檢測糖化血紅蛋白結果時提供參考.

糖化血紅蛋白;糖尿病;檢測方法;評價

1 材料與方法

1.1 實驗對象實驗標本主要來自天津市泰達醫院體檢中心、內分泌科和內科門診及住院病房的被檢者.正常對照組45例,其中男23例,女22例,年齡24~57歲,為本院體檢無糖尿病(diabetic mellitus,DM)的健康者;DM患者44例,其中男23例,女21例,年齡45~65歲.以上標本均為空腹靜脈采血2ml,EDTAK2抗凝.

1.2 儀器采用美國伯樂公司D-10型全自動糖化血紅蛋白分析儀(HPLC法)、法國Sebia公司的HYDRASYS型全自動蛋白電泳儀(電泳法)、挪威產NycoCard Reader II多功能全定量特種蛋白儀(硼酸親和法)、日立7600型全自動生化儀(酶法和膠乳凝集法)分別測定糖化血紅蛋白.

1.3 試劑D-10型分析儀洗脫緩沖液1、2、3和溶血素/清洗液均由美國伯樂公司提供;電泳法的瓊脂糖膠板、染液、加樣梳、溶血素等均由法國Sebia公司提供;硼酸親和法的試劑盒由上海奧普生物醫藥有限公司提供;酶法采用的試劑盒由日本的積水醫療株式會社提供;膠乳凝集法的膠乳、抗體、緩沖液和溶血劑由北京強申醫學科技有限公司提供.并且,各方法試劑均用其公司相應批號的標準液和質控液進行定標和質控監測.

1.4 HbA1c檢測各種檢測方法的操作均按各自試劑盒說明書進行.每一份標本在同樣條件下用五種方法檢測,記錄測定結果,用于對比分析.

1.5 精密度分析選擇具有醫學決定水平的正常和異常濃度的樣本,分別采用5個樣本,批內在同一天內重復20次;批間分別在7d內進行10次測試.計算出批內和批間的均值、標準差和CV值[1].

1.6 線性稀釋分析收集HbA1c高的糖尿病患者的抗凝血,同時收集當天健康者的抗凝血.用0.9%生理鹽水稀釋成5個濃度梯度的樣本,從低濃度到高濃度做直線回歸分析,觀察其線性范圍[2].

1.7 干擾試驗分別在血標本中添加56mmo/L葡萄糖、25mmo/L三酰甘油、3.4mmol/L膽紅素,以及,均分別取初始濃度標本的1/5、2/5、3/5、4/5、5/5加入樣品進行測試.用低溫凍融方法制備輕度(Hb< 1g/L)、中度(Hb1~4g/L)以及嚴重溶血標本(Hb>5g/L)分別進行測試.在各種干擾物不同濃度的影響下,如果HbA1c的值上下浮動0.3%,則將視為受到干擾[2].

1.8 統計學處理采用SPSS16.0統計軟件包對所測結果進行配對t檢驗(以HPLC組的實驗數據為參照組),檢驗水準α=0.05.

2 結果

2.1 精密度按照美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)文件要求的批內、批間CV應小于5%[3],5種方法中除外硼酸親和法,其他4種方法均符合要求;相對而言,D-10儀的精密度更佳.見表1.

表1 5種方法測定HbAlc的批內及批間精密度結果

2.2 線性范圍將HbA1c值為10.0的全血用HbA1c值為5.2的血進行梯度稀釋,結果及線性圖如下.見表2.

表2 5種方法線性HbAlc試驗結果

2.3 干擾實驗當加入各種干擾因素時,結果顯示HPLC法、酶法、膠乳凝集法測得的HbA1c值上下浮動<0.1%,可見性能穩定、不易受到各種干擾物的影響;電泳受溶血影響非常大;硼酸親和法對溶血標本顯示濃度太低時測不出數,脂血標本顯示濃度太高測不出數.

2.4 對比試驗用SPSS16.0統計軟件處理所有測定數據,得出以高效液相色譜法為自變量(x)、其它4種方法為因變量(Y)的回歸方程及相關系數r.另外,通過標本量、測定時間、CV、r等指標進行比較, D-10型各種指標遠優于其他方法,見表3.

表3 5種方法測HbA1c主要參數比較

3 討論

糖化血紅蛋白(HbA1c)作為糖尿病篩選、診斷、血糖控制范圍、療效考核的有效檢測指標,在臨床中得到廣泛的應用.檢測HbA1c的方法很多,有高效液相色譜法、電泳法、親和層析法、酶法和免疫法等.由于高效液相色譜(HPLC)法測定HbA1c使其準確性和重復性得到很大的提高,被公認為監測糖尿病血糖控制的金標準[4].

3.1 精密度由表1可見,高效液相色譜法(HPLC)作為金標準,批內和批間精密度在所采用的5種方法中是最好的,因此法不需對標本進行預處理,全自動檢測,人為干擾因素小;其次為酶法和膠乳凝集法,而硼酸親和法的重復性則相對較差,因其要求手工操作熟練準確、加樣精確、層析均勻,故而操作對結果的準確性有一定影響.電泳法結果與實驗人員掃描和對電泳的波峰判斷有關,主觀隨意性較大,要求實驗人員技術嫻熟、經驗豐富,否則結果差異較大.

3.2 線性試驗觀察表2顯示的數據及相應的折線圖,可知HPLC法與理論值的相關性最好,且線性范圍最寬;硼酸親合法的線性圖稍成S形,且濃度越高,偏差越大,可能與其測定結果為總的糖化血紅蛋白(所有糖化的血紅蛋白)有關.

3.3 干擾實驗56mmol/L葡萄糖、25mmol/L三酰甘油和3.4mmol/L膽紅素對HPLC法、酶法和膠乳凝集法均無干擾,可見性能穩定、抗干擾能力較強;但是脂血和溶血標本對電泳法和硼酸親和法影響很大-電泳受溶血影響非常大,嚴重溶血后比溶血前測得的值要明顯偏低;硼酸親和法對溶血標本顯示濃度太低、脂血標本顯示濃度太高,均無法測定.

3.4 對比試驗與參考范圍表3的結果表明,5種方法同時檢測同一標本時,酶法與HPLC法的結果最接近.另外,以HPLC法為參比(X),其他4種方法分別為因變量(Y)得出回歸方程并進行配對t檢驗,得出各個txy均大于tα,P<0.05,說明各組差異均有統計學意義.5種方法的參考范圍分別為4.5% ~6.3%、3.6%~5.6%、4.5%~6.3%、4.3%~5.8%和3.8%~5.8%.

美國伯樂公司的全自動糖化血紅蛋白分析儀是采用離子交換高效液相色譜分析,可對血液總血紅蛋白中的HbA1c(%)進行分析,利用3種不同濃度洗脫液進行梯度分離,將其與其他組分(FP、HbA1a、HbA1b、HbF、HbAO)區分開,同時還測定出HbA1、HbF的值,并且比較方便于插入急診,CV值小于1%,性能穩定不易受到各種共存干擾物的影響,全程自動化工作無人為因素的影響,具有精密度高、測試速度快、操作簡便等特點,為醫生調整糖尿病治療方案提供確實可靠的依據.此方法曾應用于美國糖尿病控制與并發癥研究,是目前檢測HbA1c的金標準.D-10檢測HbA1c能快速準確地為醫生提供糖尿病患者血糖控制狀況的信息,從而能妥當地調整治療方案,減少因實驗室誤差所帶來的誤診、誤治.法國Sebia公司的全自動蛋白電泳儀,在工作中發現測定糖化血紅蛋白需成批進行樣本分析,速度比較慢,無法進行實時檢測,自動化程度較差,所測結果與技術人員掃描和對電泳的峰波判斷有關,隨意性較大,且無急診插入和自動維護等功能,但具有可發現異常血紅蛋白的功能.硼酸親和層析法,操作簡便易行、試劑穩定,不需貴重儀器,但測定結果為總糖化血紅蛋白,與其他方法所測結果比較時應注意.酶法和膠乳凝集法都具有相當好的重復性,成本較低,不需要額外添置儀器,但放入儀器之前均需要做離心和混合溶血素的預處理,相對D-10儀操作不夠簡便.

[1]周新,涂植光.臨床生物化學和生物化學檢驗[M].第3版.北京:人民衛生出版社,2006:33.

[2]楊昌國,許葉.線性評價和干擾試驗中NCCLS評價方案的應用[J].臨床檢驗雜志,1999,17(3):47-49.

[3]楊昌國,許葉.精密度評價和方法比較中NCCLS評價方案的應用[J].臨床檢驗雜志,1999,17(1):184-198.

[4]宋銀丹,段勇.糖化血紅蛋白檢測標準化的研究進展[J].實驗與檢驗醫學,2013,31(2):108-110.

R446.62,R587.1,R446.11+2

A

1674-1129(2014)03-0252-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.007

2013-09-11;

2014-03-28)

田偉,男,1982年出生,本科學歷,初級技師,研究方向為臨床生物化學檢驗.