磷酸鹽對草魚肌原纖維蛋白結構的影響

曾淑薇，李 吉，熊善柏，黃琪琳

（華中農業大學食品科學技術學院，國家大宗淡水魚加工技術研發分中心（武漢），湖北 武漢 43 0070）

磷酸鹽對草魚肌原纖維蛋白結構的影響

曾淑薇，李 吉，熊善柏，黃琪琳*

（華中農業大學食品科學技術學院，國家大宗淡水魚加工技術研發分中心（武漢），湖北 武漢 43 0070）

以草魚肌原纖維蛋白為對象，研究三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）和焦磷酸鈉（sodium pyrophosphate，SPP）的添加量對肌原纖維蛋白溶解度和濁度、二級結構和表面疏水性、總巰基和活性巰基含量的影響。結果表明：隨著磷酸鹽添加量的增加，肌原纖維蛋白溶解度升高，濁度下降；蛋白鏈 伸展使得α-螺旋含量有所降低，β-轉角含量升高；同時穩定蛋白二級結構的作用力如表面疏水性、總巰基以及活性巰基含量也均增加。結論：磷酸鹽可以改變蛋白質的結構特性，且SPP相對TPP而言，對肌原纖維蛋白結構的影響更為顯著。

肌原纖維蛋白；磷酸鹽；巰基；疏水性；二級結構

草魚是一種典型的植食性魚類，是我國重要的淡水魚魚糜原料之一。草魚肌原纖維蛋白是魚肉蛋白質的重要組成部分，占肌肉蛋白質的60%～75%，是魚糜制品彈性凝膠體的主要成分，肌原纖維蛋白的性質會直接影響魚肌肉的加工適性。

磷酸鹽是肉制品加工中常用的品質改良 劑，影響肉的加工性質以及肉制品的質構、持水等特性，其中堿性磷酸鹽應用較為廣泛，如三聚磷酸鹽、 焦磷酸鹽等[1]。研究發現，磷酸鹽不僅能夠提高產品的乳化穩定性和保水性、降低產品的蒸煮損失，在加工 中還可用于部分替代氯化鈉以降低食鹽的用量。因此，磷酸鹽常與其他添加劑進行復配以提高肉制品的品質，同時還可增加肉制品的黏著性，在維持低鹽肉腸的凝膠強度和保水性方面具有獨到的作用[2-3]。但是，添加過多的磷酸鹽會降低肉制品的食用品質，甚至還會危害人體健康[4-5]。在實際生產中，由于不同磷酸鹽的作用機理不完全相同，其對產品加工的影響也不同[5]。

磷酸鹽是具有緩沖作用的堿性物質，對改善肌肉蛋白質功能的作用主要在于提高pH值、增加離子強度以及磷酸鹽和蛋白之間的相互作用，并通過協助肌球蛋白和肌動蛋白溶解以及提高肉的保水性來改善肌肉的嫩度[6]。目前，關于磷酸鹽改善肉及其制品品質的研究已經很多，但對磷酸鹽在魚肉加工中的作用機理少有報道。本研究擬通過磷酸鹽對草魚肌原纖維蛋白溶膠結構性質的影響分析，考察蛋白濁度和溶解性、二級結構以及表面疏水性、巰基的變化，探討魚肉制品品質改良劑的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚，體質量1 500 g左右，購于華中農業大學菜市場。

焦磷酸鈉（sodium pyrophosphate，SPP） 上海國藥集團化學試劑有限公司；三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP） 天津光復精細化工研究所；Tris 中國醫藥集團上海化學試劑公司；5,5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB） 上海生物工程公司；1-苯胺萘-8-萘磺酸鹽（8-naphthylamine-1-sulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Avanti J-26 型高速離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；F-4600熒光分光光度計 日本日立高新技術公司；J-1500圓二色譜儀 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取與磷酸鹽-蛋白復合樣品制備

參照Sun Fengyuan等[7]的提取方法，取新鮮絞碎的草魚魚糜用5 倍體積的低鹽緩沖液（0.05 mol/L NaCl和20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）攪拌均勻，于4 500 r/min離心10 min，重復漂洗3 次；然后 用4 倍體積的高鹽緩沖液（0.45 mol/L NaCl和20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）在4 ℃條件下浸提22 h，然后于12 000 r/min離心15 min，除去上清液，用10 倍體積的冷卻水稀釋沉淀30 min左右，除去上清液，于12 000 r/min離心15 min，得到的沉淀即為肌原纖維蛋白。用Lowry法[8]測定蛋白質量濃度。

稱取質量分數為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的焦磷酸鈉和三聚磷酸鈉溶于NaCl溶液中，然后加入到肌原纖維蛋白，使NaCl的最終濃度為0.6 mol/L，于4 ℃條件下保存備用。

1.3.2 溶解度的測定

參考Xiong Youling等[9]的方法，用0.6 mol/L NaCl將肌原纖維蛋白稀釋到0.25 mg/mL，8 000 r/min離心10 min后去上清液。測定離心前后蛋白溶液的蛋白質質量濃度。溶解度按公式（1）計算。

1.3.3 濁度的測定

參考Xiong Youling等[9]的方法，用0.6 mol/L NaCl溶液將肌原纖維蛋白稀釋到1 mg/mL，40 ℃保溫30 min，快速冷卻后測定肌原纖維蛋白溶液在320 nm波長處的吸光度，即為肌原纖維蛋白溶液的濁度。

1.3.4 總巰基和活性巰基含量的測定

參考Yongsawatdigul等[10]的方法作適當修改。總巰基含量的測定：取4 mg/mL肌原纖維蛋白溶液0.1 mL，依次加入0.9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 6.8，含8 mo l/L尿素、2%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、10 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、0.1 mL 0.1% DTNB，混合均勻后40 ℃保溫25 min，快速冷卻后用酶標儀在 412 nm波長處測此溶液的吸光度。活性巰基含量的測定：5.5 mL 4 mg/mL肌原纖維蛋白溶液中加入0.1 mL DTNB，在4 ℃條件下反應1 h，用酶標儀在412 nm波長處測此溶液的吸光度。總巰基和活性巰基的含量按公式（2）計算。

式中：c0為巰基的濃度/（mol/L）；A為412 nm波長處的吸光度；ε為摩爾消光系數，此處為13 600（mol·cm）/L；D為稀釋倍數；ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 表面疏水性的測定

參考Benjakul等[11]方法作適當修改，將提取的20 mg/mL肌原纖維蛋白溶膠用0.6 mol/L的NaCl緩沖液稀釋成1、0.5、0.25、0.125 mg/mL系列的質量濃度，加入20 μL 8 mmol/L ANS的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0），反應結束后用熒光光譜儀測定其在激發波長為364 nm、發射波長為534 nm處的熒光強度，表面疏水性（So-ANS）以熒光強度與肌原纖維蛋白質量濃度對應曲線的斜率表示。

1.3.6 圓二色譜

采用J-1500圓二色光譜儀測定肌原纖維蛋白的圓二色性。將0.1 mg/mL的肌原纖維蛋白樣品放入0.1 cm光徑的石英樣品池中，在遠紫外區（195～250 nm波長范圍）對肌原纖維蛋白溶液進行掃描，掃描速率為100 nm/min，測定溫度為5 ℃。殘基平均摩爾質量取110 g/mol，采用楊氏模量用計算機模擬得出α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲二級結構單元的含量。圓二色性用平均殘基橢圓值［θ］表示（deg·cm2/dmol）。

1.4 數據分析

實驗均做3 次平行，3 次重復，數據用Origin 8.0和GraphPad Prism 5.0進行處理。

2 結果與分析

2.1 肌原纖維蛋白溶解度和濁度的變化

濁度反映了肌原纖維蛋白在蛋白溶膠中的存在狀態，可以表征蛋白質的聚集程度。由圖1可知，隨著SPP和TPP添加量的增加，肌原纖維蛋白溶膠的溶解度逐漸上升，濁度逐漸下降。當添加量為1.5%時，添加TPP的肌原纖維蛋白溶解度達到82%，而添加SPP的蛋白溶解度高達89%，相對空白樣品的72%有顯著提升；此時，添加TPP與SPP的肌原纖維蛋白濁度值分別為0.44和0.46，明顯低于空白的0.54。Yasui[12]、田銳花[13]等研究發現，只有焦磷酸鹽能夠引起肌動球蛋白構象和分子質量大小的改變，促使肌動球蛋白解離，使更多的蛋白溶解，而三聚磷酸鹽只有被肌動球蛋白上的三聚磷酸酶水解成磷酸鹽二聚體的形式在高離子強度下才能發揮作用，單獨的TPP不具備解離肌動球蛋白的作用，故SPP對蛋白溶解性和濁度的影響較TPP更為顯著。TPP作用途徑與SPP類似，TPP及SPP可以通過改變蛋白質電荷的密度來提高肉體系的離子強度，并使其偏離等電點，電荷之間相互排斥，蛋白質與蛋白質之間的排斥力也隨之增加，蛋白質之間產生更大的空間，靜電斥力使肌原纖維橫向膨脹，減緩了蛋白的凝聚，增加蛋白質的溶解[14-16]。

圖1 不同TPP和SPP添加量下肌原纖維蛋白溶解度（A）和濁度（B）的變化Fig.1 Solubility (A) and turbidity (B) of myofibrillar proteins in the presence of TPP and SPP at different concentrations

2.2 二級結構

圖2 不同TPP（A）和SPP（B）添加量下肌原纖維蛋白二級結構的變化Fig.2 Secondary structure of myofibrillar proteins in the presence of TPP (A) and SPP (B) at different concentrations

圓二色譜法是研究蛋白質二級結構的有效手段。由圖2A可知，隨著TPP的添加，肌原纖維蛋白的α-螺旋含量逐漸降低，從49.7%降至41.8%，而β-折疊的含量由5.6%升至10.8%，無規卷曲的含量變化不大。由圖2B可知，SPP的添加使α-螺旋從49.7%降至42.9%，β-折疊從5.6%升高到9.6%，無規卷曲含量略有下降。磷酸鹽的加入會增加肌原纖維蛋白的溶解性，從而增大蛋白質之間的空間距離，分子鏈的伸展使得肌球蛋白尾部的α-螺旋鏈部分解開，同時加強了維持二級結構穩定的作用力，使得肌原纖維蛋白α-螺旋向β-折疊和β-轉角轉化，蛋白結構更為伸長[17-19]。

2.3 表面疏水性

圖3 不同TPP和SPP添加量下肌原纖維蛋白表面疏水性的變化Fig.3 So-ANS of myofibrillar proteins in the presence of TPP and SPP at different concentrations

蛋白質的表面疏水性反映了蛋白質分子表面疏水性氨基酸的相對含量。由圖3可知，隨著SPP和TPP添加量的增加，肌原纖維蛋白溶膠的表面疏水性逐漸增加。當添加量小于0.9%時，添加TPP的肌原纖維蛋白的疏水性略高于SPP，隨著添加量的進一步增加，添加SPP的肌原纖維蛋白的疏水性明顯高于TPP。添加磷酸鹽后，肌原纖維蛋白表面疏水性的增加主要歸因于蛋白質分子鏈的伸展，從而引起疏水側鏈的暴露，主要包括芳香族氨基酸及疏水性脂肪族的暴露，使肽鏈螺旋結構發生變化[20-22]。同時磷酸鹽的添加提高了蛋白溶膠的離子強度，使蛋白的溶解性增強，更多的自由水進入蛋白內部，水分子的流動性增強，使得疏水基團周圍的水的熵值增加，而蛋白溶膠系統熵的增加是疏水相互作用的主要動力[23]。

2.4 總巰基和活性巰基

圖4 不同TPP和SPP添加量下肌原纖維蛋白總巰基（A）和活性巰基（B）含量的變化Fig.4 Total SH (A) and active SH (B) contents of myofibrillar proteins in the presence of TPP and SPP at different concentrations

巰基是魚肌原纖維蛋白中最具反應活性的功能性基團，在穩定肌原纖維蛋白的空間結構中起重要作用。總巰基包括活性巰基和隱藏在分子內部的巰基，而活性巰基主要位于肌球蛋白頭部重鏈。由圖4可知，隨著SPP和TPP添加量的增加，肌原纖維蛋白溶膠的總巰基和活性巰基含量均呈上升趨勢。磷酸鹽的加入使得蛋白結構部分展開，二硫鍵斷裂形成巰基暴露，總巰基含量增加。結合圖1、4可知，蛋白溶解度和巰基的變化趨勢相同，可知蛋白的溶解度提高，使得包埋在分子內部的巰基部分巰基暴露，從而增加活性巰基的含量[24-25]。

3 結 論

TPP和SPP通過靜電斥力使肌原纖維橫向膨脹，提高離子強度以增加蛋白質的溶解，使蛋白質的分子鏈伸展，蛋白質與蛋白質之間的排斥力增加、聚集作用力減小即濁度降低。肌球蛋白尾部的α-螺旋鏈部分解開，α-螺旋向β-轉角轉化，蛋白空間結構更為伸展，這與維持二級結構穩定的相互作用力的變化有直接的關系。蛋白質分子鏈的伸展使得疏水性脂肪族和包埋在分子內部的巰基的暴露，表面疏水性和活性巰基含量增加。而且加入SPP后肌原纖維蛋白結構的變化相對加入TPP后的更為顯著，主要是由于SPP能夠促使肌動球蛋白解離，而TPP只有被水解成磷酸鹽二聚體的形式才能發揮作用，單獨的TPP沒有解離肌動球蛋白的作用。磷酸鹽對肌原纖維蛋白的作用多歸結于它們的pH值和離子強度的變化，進而對蛋白結構產生影響，但如何將其應用于產品加工與肉類品質改良還需要進一步研究結構與功能特性之間的關系。

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Effects of Phosphates on the Structure of Myofibrillar Proteins from Grass Carp Muscle

ZENG Shu-wei, LI Ji, XIONG Shan-bai, HUANG Qi-lin*
(National R&D Branch Center for Conventional Freshwater Fish Processing (Wuhan), College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, C hina)

The effects of sodium tripolyphosphate (TPP) and sodium pyrophosphate (SPP) at v arious concentrations on the structure of myofibrillar proteins from grass carp muscle were studied. With an increase in the amount of two phosphates, the solubility of myofibrillar proteins increased obviously, while the turbidity decreased. The total and active sulfydryl contents as well as the hydrophobicity of myofibrillar proteins increased with increasing concentration of phosphates. The secondary structure of myofibrillar proteins was studied by circular dichroism, and the content of α-helix decreased accompanied by a final increase in β-sheet due to the change of the interaction force that maintained the structural stability. These results indicated that the two phosphates could influence the structure of myofibrillar proteins mainly through the increase in solubility, ionic strength and i nteraction force, which induced unfolding of the protein chain and expansion of the spatial distance of protein so as to alter the properties of myofibrillar proteins. In addition, SPP had more obvious effect on the protein structure than TPP when added to the myofibrillar proteins.

myofibrillar proteins; phosphate; sulfydryl; hydrophobicity; secondary structure

TS254.1

A

1002-6630（2014）23-0048-04

10.7506/spkx1002-6630-201423010

2014-06-30

國家現代農業（魚）產業技術體系建設專項（CARS-46-23）；武漢市應用基礎研究計劃項目（2014020101010068）

曾淑薇（1990—），女，碩士研究生，研究方向為水產品蛋白結構與功能特性。E-mail：zsw_hzau@126.com

*通信作者：黃琪琳（1974—），女，副教授，博士，研究方向為蛋白質多糖等食品大分子的結構和功能特性。E-mail：hql@mail.hzau.edu.cn