食鹽用量對四川臘肉加工及貯藏過程中肌肉蛋白質降解的影響

張 平，楊 勇，曹春廷，鞏 洋，郭艷婧，呂 舒，劉超楠，楊 莎，李 誠，胡 濱，何 利

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

食鹽用量對四川臘肉加工及貯藏過程中肌肉蛋白質降解的影響

張 平，楊 勇*，曹春廷，鞏 洋，郭艷婧，呂 舒，劉超楠，楊 莎，李 誠，胡 濱，何 利

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

以不同食鹽用量（食鹽用量分別為原料肉質量的3%、4%、5%、6%、7%，用A、B、C、D、E來表示）腌制的四川臘肉為研究對象，分析了肌肉中非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）、游離氨基酸（free amino acids，FAA）含量以及肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在加工貯藏過程中隨時間變化的規律。結果顯示：A、B、C組NPN含量較高；C組FAA含量最高，含量最高時達到11.75 mg/g；肌漿蛋白、肌原纖維蛋白在臘肉的腌制期和煙熏期大量降解，而肌原纖維蛋白的降解主要集中在分子質量大于99 kD的區域，A、B、C組的兩種蛋白變化趨勢一致，D、E組一致。結果表明：食鹽用量會抑制蛋白質的降解，當食鹽用量為肉質量的5%時，最有利于游離氨基酸的生成，并且臘肉中較低的食鹽用量會縮短貯藏階段肌漿蛋白含量達到最大值的時間，卻延緩了肌原纖維蛋白含量達到最大值的時間。

食鹽用量；四川臘肉；蛋白質降解；肌漿蛋白；肌原纖維蛋白

四川臘肉，是指用食鹽、花椒等香料腌制，再經過晾曬或煙熏而成的肉制品，有悠久的歷史和文化背景，因其具有色澤鮮明、皮肉紅黃、肥膘透明或乳白、風味獨特，深受廣大消費者的喜愛。國內外對臘肉等腌臘制品的研究發現，蛋白質降解生成的肽類、游離氨基酸等非揮發性物質對肉制品風味的形成具有十分重要的作用，蛋白質中降解程度最大的兩種組織蛋白為肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，這兩種組織蛋白降解產生的非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）等成分對肉制品品質有重要影響[1-2]。有研究發現，四川臘肉中游離氨基酸（free amino acids，FAA）含量的升高是其獨特風味形成的重要原因，而高含量的纈氨酸、丙氨酸等可能對其特征風味的形成有重要影響[3]。

臘肉最初是人們為了便于長期貯藏發明而來的，在沒有冷藏和保鮮技術的過去，唯有通過使用大量食鹽來降低產品的含水量從而達到長期保存的目的。臘肉中高濃度的食鹽含量既增加了產品發酵周期，又會使廠家生產成本上升[4]，也會使人體因攝入過多食鹽，而引發高血壓、心臟病等心血管病。有學者發現，蛋白質降解隨著含鹽量上升逐漸減弱，鹽過多則完全抑制蛋白降解；在加工過程中降低食鹽用量則可能會導致肌漿蛋白降解過度，肌肉組織軟化[5-7]；也有報道指出，金華火腿中食鹽含量的增加與其游離氨基酸含量的升高呈負相關[8]。

近年來已有學者開始從事不同食鹽用量對火腿中蛋白質降解影響的研究[9]，而關于食鹽用量對四川臘肉蛋白質降解的影響尚無報道。因此本實驗以不同食鹽用量的四川臘肉為研究對象，對其非蛋白氮、游離氨基酸含量、肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的變化情況進行研究，為指導四川臘肉的生產及低鹽臘肉的生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肋條肉、花椒和食鹽，均采購于當地市場。

考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、Tris堿、丙烯酰胺、甘氨酸、甲叉丙烯酰胺、過硫酸銨、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TMED） 美國Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、迭氮鈉、碘化鉀、溴酚藍、磷酸、甘油、氫氧化鈉、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅等均為分析純。

1.2 儀器與設備

TS-2000A搖床 海門市麒麟醫用儀器廠；L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司； ST16R高速冷凍離心機 北京 博儀恒業科技發展有限公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋、DHG29345A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒公司；DYY-6D電泳儀、DYC2-24DN電泳槽 北京六一儀器廠；Gel-Doc-XR+凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 四川臘肉的加工和采樣方法

1.3.1.1 四川臘肉的加工方法

腌制前的準備：首先將豬肋條肉（每塊質量0.8～1 kg，總質量50 kg）平均分為5 組（每組各5 塊），然后以每組肉質量的3%、4%、5%、6%、7%來計算腌制時所使用的食鹽用量，花椒使用量均按照每組肉質量的0.6%來稱量。

腌制：先將食鹽與花椒放入鍋中炒熟→冷卻后再用小鏟將鹽和花椒均勻涂抹在肉塊上→放入缸中腌制7 d（密封）→取出晾干半天→最后再用柏樹枝發煙熏制3 d（煙熏時室內溫度（40±2）℃，白天熏烤8 h，晚上停止熏烤）→室溫晾掛，即得成品。

1.3.1.2 樣品采集

用字母A、B、C、D、E分別表示食鹽用量為原料肉質量3%、4%、5%、6%、7%的臘肉樣品，取四川臘肉在加工貯藏過程中的11 個工藝點， 0（原料肉）、4（腌制中期）、7（腌制結束）、10（煙熏結束）、15、20、30、40、60、90、120 d的臘肉肌肉作為指標測定樣品。采樣時從各組樣品的每塊臘肉（共5 塊）上割下肌肉約40 g（共200 g），剔除脂肪及表面的花椒粒，切細后用組織搗碎機絞碎，以備實驗使用。

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 非蛋白氮含量測定

稱取絞碎臘肉樣品10 g于三角瓶中，并加入90 mL蒸餾水，振搖30 min，取25 mL濾液，并加入25 mL 10%三氯乙酸溶液，過濾后取10 mL濾液消化，最后進行凱氏定氮。

1.3.2.2 游離氨基酸含量測定

參照竺尚武等[2]的方法。取充分絞碎臘肉樣品約30 g，60 ℃烘干后粉碎，然后稱取約1 g粉末樣品加入20 mL 75%的酒精，并在80 ℃水浴上萃取1 h，將上清液倒入小燒杯中，重復以上操作3 次，并且在水浴上蒸發掉酒精，然后將剩余液體移入分液漏斗，加入10 mL乙醚萃取脂肪，水層于水浴上蒸干備用，再用0.02 mol/L鹽酸洗入容量瓶，離心15 min，取上清液用氨基酸自動分析儀測定，測定方法參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》進行。

1.3.2.3 肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的制備

參照江玉霞[6]的方法稍作改動：稱取絞碎臘肉肌肉樣品5 g，加入0.03 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）30 mL均質后，在4 ℃下放置20 min，同溫度下10 000×g離心20 min，離心2 次并合并上清液，將上清液透析過夜，即為肌漿蛋白。將上述沉淀按質量與體積比1∶10同0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸鹽緩沖液（含有KI和NaN3，濃度為0.7 mol/L、0.02%）混合均勻，4 ℃下磁力攪拌30 min后，同溫度下10 000×g離心20 min 得到上清液，重復操作一次，合并上清液，上清液透析過夜，即為肌原纖維蛋白。

1.3.2.4 蛋白質量濃度的測定

采用考馬斯亮藍法測定肌漿蛋白、肌原纖維蛋白的蛋白質量濃度。

1.3.2.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）

以分子質量范圍為6.5～200 kD的寬分子標準蛋白作為對照，采用SDS-PAGE分析四川臘肉肌肉組織在加工及貯藏過程中肌漿蛋白、肌原纖維蛋白的降解情況，分離膠質量分數為12%，濃縮膠質量分數為4%[10-11]。

上樣：將待測蛋白質質量濃度稀釋到1 mg/mL左右，吸取50 μL蛋白提取液，與5×上樣緩沖液以1∶1的比例混合，沸水浴10 min，冷卻后上樣，上樣量為15 μL。

電泳：接通電泳儀，將電壓調節至80 V開始電泳，直至溴酚藍前沿進入分離膠，將電壓調至100 V，繼續電泳至溴酚藍到達分離膠底部上方約1 cm處，關閉電源。

染色與脫色：將凝膠放入染色液（V（甲醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=5∶2∶13，1.2×103mol/L考馬斯亮藍R-250）中染色1～2 h；再用脫色液（V（冰醋酸）∶V（乙醇）∶V（水）=2∶1∶17）脫色，直到蛋白質區帶清晰。

1.4 數據處理

數據用SPSS統計軟件描述性分析與方差分析程序進行處理。

2 結果與分析

2.1 四川臘肉在加工及貯藏過程中NPN含量的變化

圖1 四川臘肉在加工及貯藏過程中NPN含量的變化Fig.1 Changes in non-protein nitrogen in Sichuan bacon during processing and storage

非蛋白氮含量是指除蛋白質以外的多肽、短肽以及FAA等的總含量，主要是由蛋白質發生降解所產生的。由圖1可知，腌制中期，NPN含量均顯著下降（P＜0.05），可能是腌制時水分的溢出導致水溶性蛋白質滲出而流失；腌制結束后，含量均上升，這與陳美春[12]、江玉霞[6]的研究結果相同。經過煙熏，NPN含量繼續上升，可能是由于煙熏時較高的溫度促進了蛋白質的進一步分解。

NPN含量在整個貯藏過程中上升、下降趨勢交替出現，在貯藏第20、40天，含量下降，可能是由于溫度的降低造成了微生物以及蛋白酶活性降低，從而使蛋白質降解程度減弱；貯藏第60天時，NPN含量再次下降，可能是由于成熟后的臘肉產生的游離氨基酸、肽類等與脂肪水解所產生的各種脂肪酸發生反應產生了部分揮發性的含氮物質，從而造成非蛋白氮含量下降[13]。貯藏后期，NPN含量開始上升，尤其是從貯藏第90天到第120天，上升明顯（P＜0.05），這是因為環境中的高溫使組織蛋白酶和氨肽酶的活性上升，使蛋白質降解產生非蛋白氮[14]。在貯藏過程中，A、B、C組NPN含量高于D、E組，并且在貯藏第120天時，D（4.78%）、E（4.65%）組NPN含量與原料肉（4.19%）差異不明顯（P＞0.05），而A（6.24%）、B（5.33%）、C（5.49%）組與原料肉差異顯著（P＜0.05），而蛋白質的降解程度與NPN的變化相似，說明臘肉中的食鹽用量對蛋白質降解具有抑制作用，這與劉洋[15]的研究結果基本一致；并且在臘肉的整個加工貯藏過程中，較高的食鹽用量（肉質量的6%、7%）對其肌肉蛋白NPN含量的變化幾乎無影響。

2.2 四川臘肉在加工及貯藏過程中游離氨基酸含量的變化

選取四川臘肉在加工及貯藏過程中游離氨基酸變化具有代表性的A、C、E組臘肉進行分析。

2.2.1 四川臘肉在加工過程中游離氨基酸含量的變化

表1 四川臘肉在加工過程中游離氨基酸含量Table1 Changes in free amino acids in Sichuan bacon during processing

由表1可知，經過腌制，Cys含量從0.34 mg/g下降到0.07 mg/g左右（P＜0.01），其余各種氨基酸含量整體呈上升趨勢，這與趙改名等[16]的研究結果一致，說明食鹽可以促進原料肉中蛋白質的降解，產生游離氨基酸；煙熏結束，同腌制結束時相比，除Asp、Cys含量變化不顯著外（P＞0.05），其余各種氨基酸含量繼續增加，這是由于煙熏時溫度升高，酶活性升高促進了蛋白質的降解，從而產生更多的游離氨基酸[17]。經過加工后，含量較高的游離氨基酸有Thr、Glu、Ala、Lys等，其他游離氨基酸的含量均都超過其呈味閾值，對臘肉風味的形成十分重要[18]。在整個加工過程中，A、C組游離氨基酸含量整體高于E組，其中A組臘肉無論是游離氨基酸總量還是各種單獨的游離氨基酸含量均最高，在加工末期，A組中Ala含量達到1.07 mg/g，游離氨基酸總量為7.09 mg/g，游離氨基酸含量顯著高于其他各組（P＜0.05）。

2.2.2 四川臘肉在貯藏過程中游離氨基酸含量的變化

由表2可知，在貯藏過程中，Cys含量變化 不顯著（P＞0.05），可能是由于半胱氨酸是胱氨酸的氧化形式，半胱氨酸卻擁有容易參加氧化等反應的硫氫基，從而失去其氨基酸特性，這與趙改名[16]的研究結果一致。從加工結束（即煙熏結束）到貯藏第60天，各種游離氨基酸含量整體呈上升趨勢，含量較高的游離氨基酸為Thr、Ser、Glu、Gly、Val、Ala、Leu、Arg，相較于加工時期，種類有所增加，它們對產品風味有不同的作用：Glu具有鮮味，Ala、Ser具有甜味，Leu、Val具有苦味[19]。從貯藏第90天開始，除A組游離氨基酸含量繼續保持上升趨勢外，C、E組含量開始下降。A組游離氨基酸含量在貯藏第120天的時候也開始下降，可能是因為A組食鹽用量較低，在貯藏后期，其食鹽濃度上升后才達到了抑制氨肽酶活性的濃度，從而抑制了蛋白質的降解，也可能與游離氨基酸參與揮發性風味物質如3-甲基正丁醛生成的相關反應有關[19-20]。在整個貯藏階段，A、C組游離氨基酸含量整體高于E組，其中C組含量最高，說明食鹽用量為肉質量的5%時是使肌肉蛋白質降解生成游離氨基酸的最適食鹽用量，當食鹽用量低于肉質量的5%時，游離氨基酸含量有所下降，當食鹽用量高于肉質量的5%時，游離氨基酸含量顯著降低。C組游離氨基酸含量在貯藏第60天時最高，為11.75 mg/g，Glu、Ala、Lys含量分別達到1.34、1.59、1.19 mg/g。

表2 四川臘肉在貯藏過程中游離氨基酸含量的變化Table2 Changes in free amino acids in Sichuan bacon during storage

在整個加工貯藏過程中，Glu、Ala、Lys為主要游離氨基酸，同羅珺等[21]測得的臘肉中Arg和Glu含量最高，陳美春[12]測得的四川臘肉Val和Ala含量最高均不同，可能與實驗原料不同有關。本實驗臘肉中游離氨基酸總量在貯藏第120天時，總含量最高的是原料肉的2.64 倍，最少的也有1.37 倍；His含量變化不明顯，這是由于臘肉中存在醛類化合物，而這種氨基酸能與還原性化合物進行強烈的美拉德反應[19]。

2.3 四川臘肉在加工及貯藏過程中肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的降解

2.3.1 四川臘肉在加工及貯藏過程中肌漿蛋白的降解

圖2 四川臘肉在加工及貯藏過程中肌漿蛋白SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of sarcoplasmic protein in Sichuan bacon during processing and storage

由圖2可知，經過7 d的腌制，所有處理組227（f1）、157（f2）、83（f3）、23（f6） kD的條帶顏色變深，同時也有其他小分子質量的蛋白片段生成，這些片段對臘肉滋味及風味物質的生成具有貢獻[22]，其余蛋白片段均發生降解，說明食鹽的腌制使肌漿蛋白大量降解，這與江玉霞[6]的研究發現一致；腌制過程中，157 kD（f2）條帶顏色隨著食鹽用量的增加變化不明顯，83 kD（f3）條帶顏色隨著食鹽用量的增加而變淺；而16 kD（e1）條帶腌制后幾乎消失，這與廖定容[23]研究雅安罐罐肉時條帶顏色加深相反，可能與食鹽用量及腌制時間的長短有關。經過煙熏，許多大分子蛋白片段消失，各條帶顏色均變淺，說明蛋白質濃度低，肌漿蛋白的含量較少，表明煙熏使肌漿蛋白發生了大量的降解和變性，而67 kD（f4）條帶顏色確略有加深；大分子條帶的消失可能是由于高溫使肌漿蛋白質過度聚合變性，發生變性后因為不溶而沒有被提取出來，也可能是高溫使蛋白片段生成游離氨基酸等小分子物質[24]。煙熏后的蛋白條帶顏色D、E組比A、B、C組更深，可能是在腌制期，肌漿蛋白在高濃度食鹽的作用下發生變性，煙熏時的高溫對其影響相對較低。

進入貯藏期后，有大量的蛋白片段生成，小于24 kD的區域也有大量的小分子片段生成，包括經過煙熏后幾乎消失的27（f5）、23（f6） kD條帶，可能是蛋白質的溶解度在煙熏后下降，煙熏結束后溶解度上升，大分子質量的蛋白質分解所產生的。A、B、C組臘肉的肌漿蛋白變化趨勢一致，在貯藏第90天時蛋白片段含量最高，在貯藏第120天時，肌漿蛋白再次發生降解；D、E組肌漿蛋白則是在貯藏第120天時蛋白片段含量最高，貯藏后期與A、B、C組肌漿蛋白變化趨勢存在較大差異。

2.3.2 四川臘肉在加工及貯藏過程中肌原纖維蛋白的降解

圖3 四川臘肉加工及貯藏過程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE of myofibrillar protein in Sichuan bacon during processing and storage

由圖3可知，腌制后，分子質量大于188 kD的肌原纖維蛋白片段發生了降解，如241 kD（k1），同時一些分子質量低于188 kD的蛋白條帶顏色加深，生成了新的蛋白片段34 kD（r1），這與江玉霞[6]的研究金華火腿在加工過程中的情況基本一致，與Solange等[25]研究法國干腌火腿時肌原纖維蛋白 幾乎沒發生降解作用不同，可能是環境及加工工藝的不同所造成的，說明食鹽的腌制作用促進大分子質量（＞188 kD）的肌原纖維蛋白的降解，小分子物質的生成則是由于大分子蛋白片段的降解而產生的。煙熏后，除42 kD（p2）和分子質量大于99 kD（p1）蛋白片段幾乎消失，24（p3）、18（p4） kD條帶顏色變淺外，其余條帶顏色均加深，蛋白條帶消失和變淺可能是高溫使其變性致使溶解性下降，而條帶顏色的加深既可能是大分子降解，也可能是較小分子聚合而成[26]。

貯藏期間，A、B、C組肌原纖維蛋白條帶在貯存第60天時蛋白片段含量最高，差異不明顯，D、E組則在煙熏結束后蛋白片段含量已經達到最高，各組樣品在隨后的貯藏過程中變化不明顯，可看出肌原纖維蛋白的熱穩定性顯著高于肌漿蛋白，這與廖定容[23]研究經高溫油炸后罐罐肉在貯藏期間的情況一致；D、E組在貯藏過程中變化不明顯，是因為其食鹽含量高，在食鹽的高 滲透壓作用下，肌肉中的酶活性逐漸被抑制，被抑制活性的酶不能使肌原纖維蛋白降解，因此條帶變化不明顯[6,23]。在整個加工貯藏過程中，食鹽對肌原纖維蛋白的降解作用主要集中在分子質量大于99 kD的區域；在貯藏過程中，A、B、C組肌原纖維變化趨勢一致，D、E組一致。

3 結 論

本研究結果表明，在整個加工貯藏過程中，不同食鹽用量的四川臘肉肌肉蛋白質發生了不同程度的降解。臘肉中的食鹽用量與NPN的變化呈負相關，較高的食鹽用量（肉質量的6%、7%）對其肌肉蛋白NPN含量的變化幾乎無影響。食鹽用量為肉質量的5%是使肌肉蛋白質降解生成游離氨基酸的最適食鹽用量。經過腌制、煙熏，肌漿蛋白發生了大量降解，而肌原纖維的降解主要集中在分子質量大于肌漿蛋白大于99 kD的區域，在貯藏階段，有蛋白片段生成，食鹽用量較低（肉質量的3%、4%、5%）會縮短肌漿蛋白含量達到最大值的時間，但會延緩肌原纖維蛋白量達到最大值的時間。

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Effect of Salt Dosage on Protein Degradation of Muscle in Sichuan Bacon during Processing and Storage

ZHANG Ping, YANG Yong*, CAO Chun-ting, GONG Yang, GUO Yan-jing, Lü Shu, LIU Chao-nan, YANG Sha, LI Cheng, HU Bin, HE Li (College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Sichuan bacon with different salt contents (3%, 4%, 5%, 6% and 7% of raw meat weight, which were individually represented by Groups A, B, C, D and E) was tested for time-related changes in non-protein nitrogen (NPN), free amino acids (FAA), sarcoplasmic protein and myof brillar protein during processing and storage. The results showed that NPN contents in Groups A, B and C were higher than in other groups. The highest FAA content, 11.75 mg/g, was observed in Group C. The degradation of sarco plasmic protein and myof brillar protein in large quantities occurred during salting and smoking stages, and the myof brillar protein with molecular weight greater than 99 kD was mainly degraded. These two proteins changed in the same trend for Groups A, B and C, and for Group C and D. These results indicated that the protein degradation could be restrained by salt addition, and more FAA could be produced when 5% salt was added. Lower content of salt could shorten the time to reach the peak level of sarcoplasm protein, but delay the appearance of the peak level of myof bril protein during storage stage.

salt dosage; Sichuan bacon; protein degradation; sarcoplasmic protein; myof brillar protein

TS251.5.1

A

1002-6630（2014）23-0067-06

10.7506/spkx1002-6630-201423014

2013-12-18

四川省科技廳科技支撐計劃項目（2012NZ0001）

張平（1988—），女，碩士研究生，研究方向為肉品科學與技術。E-mail：627122724@qq.com

*通信作者：楊勇（1969—），男，教授，博士，研究方向為肉品科學與技術。E-mail：yangyong676@163.com