素食者產雌馬酚腸道菌生長條件優化

李笑梅，賈 堯

（哈爾濱商業大學 黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

素食者產雌馬酚腸道菌生長條件優化

李笑梅，賈 堯

（哈爾濱商業大學 黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

以菌落數和光密度值以及雌馬酚含量為評價指標，測定兩株腸道菌的生長曲線，考察金屬鹽MnSO4、ZnSO4、CaCl2、Na2CO3、KNO3對其生長狀況的影響，篩查其對不同碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖）的利用情況。其次采用單因素試驗和正交試驗對生長條件進行優化。結果表明：LJ-G1 和LJ-Q2兩株菌的生長規律為在37 ℃厭氧條件下，培養6 h后進入指數期、21 h后進入生長平穩期、39 h后為衰亡期。金屬鹽對菌株生長均有抑制作用，作用最強的為MnSO4；葡萄糖對腸道菌的生長有促進作用。生長最優條件為：培養基中葡萄糖質量濃度7 g/L、pH 7.2、NaCl質量濃度2 g/L，雌馬酚的產量較高為11.89 μg/mL。

素食者；腸道菌；雌馬酚

雌馬酚（equol）是1932年Marrian等[1]在懷孕雌馬的尿液中分離羥雌酮時發現的，并確定分子式為C15H14O3。1982年Axelson等[2]在普通人的尿液中發現了雌馬酚，還證明人在攝入大豆異黃酮后能在腸道菌的參與下降解產生雌馬酚。雌馬酚經尿和膽汁排泄，排出濃度存在個體差異，受大豆異黃酮種類、腸道菌群多樣性、膳食成分等因素的影響[3-5]，其中主要取決于腸道微生物菌群的組成及代謝能力[6-8]。Kenneth等[9]通過對41 名青年人包括29 名素食者和12 名非素食主義者進行了研究，用質譜方法（mass spectrometer，MS）分析血清和尿液中大豆苷元和雌馬酚濃度，發現在素食者中雌馬酚產生者為59%，比非素食者高出25%[10-12]。

近些來，對以人糞樣為樣本分離大豆異黃酮降解菌的研究發展較快，通過對培養條件的優化和控制，獲得多種不同代謝特性的厭氧型降解菌，且多為革蘭氏陽性桿菌。2007年Uchiyama等[13]成功分離出乳酸球菌20-92、真桿菌7-430和梭菌20-197，能將大豆素（daidzein）直接轉化為雌馬酚；Jin等[14]在2008年分離得到菌株PUE和DZE，PUE能將葛根素轉化為大豆素，DZE能將大豆素和染料木素（genistein）分別轉化為Equo和15-OH-equol。Tamura等[15]于2006年分離得到的TM-40菌株，不能直接將大豆素轉化為雌馬酚，只具有將大豆苷（daidzin）和大豆素轉化為雙氫大豆素（dihydrodaidzein，DHD）的能力。在前期的研究中，采集了6 位女性素食志愿者的糞樣作為樣本，從中培養分離出LJ-G1和LJ-Q2兩株腸道菌，均為厭氧菌，LJ-G1為革蘭氏陰性桿菌，LJ-Q2為革蘭氏陽性球菌，純培養均具有代謝大豆異黃酮產雌馬酚的能力[16]。

目前雌馬酚的體外獲得主要通過兩種途徑，一是將大豆苷元從大豆中提取出后，在催化劑的作用下還原合成雌馬酚，另一種是篩選出雌馬酚產生菌，進行體外培養，以大豆苷元為底物，從培養液中得到雌馬酚[17-19]。前者成本較高，不利于雌馬酚的廣泛應用，因此利用微生物發酵法生產雌馬酚具有廣闊的前景。本研究在前期工作基礎上，研究素食者產雌馬酚腸道菌生長規律、優化菌株生長條件，為后續菌株降解大豆異黃酮的代謝研究，開發以生物發酵法制備雌馬酚提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

菌種：LJ-G1和LJ-Q2由黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室自素食者糞便分離保藏[16]。

大豆異黃酮（純度80%） 西安市天園生物制藥廠；雌馬酚標準品（純度98%） 合肥蘭旭生物有限公司；BHI 肉湯培養基 青島海博生物技術有限公司；瓊脂粉 上海山醫學化驗所試劑廠；乳糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、葡萄糖 天津市化學試劑一廠；硫酸錳、硫酸鋅、氯化鈣、碳酸鈉、硝酸鉀 吉林宏久試劑廠。

1.2 儀器與設備

YQX-Ⅱ型培養箱 上海新苗醫療機械有限公司；超潔凈工作臺 上海凈化設備有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海恒科學儀器有限公司；TU-1900型雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 添加大豆異黃酮培養基制備及菌種活化

本實驗所用器皿均在干燥箱內經150 ℃、3 h干熱滅菌，液態試劑均在壓力蒸汽滅菌器內經102.9 kPa，20 min濕熱滅菌，無菌操作在超凈工作臺下完成。

稱取9.5 g BHI肉湯培養基溶于250 mL蒸餾水中，調節pH 7.4，加入質量濃度為5 mg/mL的大豆異黃酮溶液，使其終質量濃度為0.75 mg/mL。取保存于斜面的LJ-G1和LJ-Q2菌株，將供試菌種分別接種于BHI肉湯培養基中，置于37 ℃厭氧培養12 h。取活化好的菌種斜面，用無菌生理鹽水配制菌懸液，采用平板計數法調制菌懸液濃度為106～107CFU/mL，備用[20]。

1.3.2 腸道菌生長曲線的測定

生長曲線的測定采用活菌計數法[21]。將活化后的菌液接種于裝有BHI液體培養基的試管中（n=3），接菌量體積分數5%，在48 h內每隔3 h跟蹤測定活菌數，并根據這些實驗數據繪制生長曲線[22]，進行分析，以便更好的掌握和利用其生長規律。按公式（1）計算菌數。

式中：S為培養基中總活菌數/（CFU/mL）；X1、X2、X3為同一稀釋度菌落數/（CFU/mL）；N為菌落稀釋倍數。

1.3.3 雌馬酚測定方法

雌馬酚定量測定采用紫外法[23]，將固體培養基用80%乙醇溶液充分溶解后，活性炭脫色6 h、過濾，用聚酰胺樹脂進行純化，5 h后收集純化液，以80%乙醇溶液定容，205 nm波長處測定OD值[24]。回歸方程為：y=0.174 04x＋0.006 23（R2=0.996 9）。按公式（2）計算培養基中雌馬酚含量。

式中：ρ1為培養基中雌馬酚質量濃度/（μg/mL）；V1為培養基體積/mL；V2為定容后體積/mL；ρ2為回歸方程計算得到的雌馬酚質量濃度/（μg/mL）。

1.3.4 不同種類的金屬鹽及其濃度對腸道菌生長的影響

向BHI液體培養基中分別添加MnSO4、ZnSO4、CaCl2、Na2CO3、KNO3溶液[25]，使其濃度（以培養基體積計）分別達到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，再將活化后的LJ-G1和LJ-Q2的菌液按體積分數5%接種于BHI液體培養基中，37 ℃厭氧培養36 h，以只接菌未添加金屬鹽的培養基作為對照，BHI液體培養基最大吸收波長為460 nm，因而在此波長處測定光密度（OD）值（n=3），考察各金屬鹽及不同濃度對腸道菌生長的影響。

1.3.5 不同碳源對腸道菌的影響

選取葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖5 種碳源，分別添加于BHI培養基中，質量濃度（以培養基體積計）達到10 g/L，以不添加糖為對照。分別接種稀釋度為10-5的LJ-G1和LJ-Q2菌液各0.2 mL[16]，倒置放入厭氧箱中，37 ℃培養36 h后，采用活菌計數法計數（n=3）。

1.3.6 生長條件單因素試驗

單因素試驗主要考慮葡萄糖質量濃度、pH值、NaCl質量濃度這3 個因素，在BHI固體培養基上，基礎培養條件為葡萄糖質量濃度（以培養基體積計）7 g/L、pH 7、NaCl質量濃度（以培養基計）4 g/L。接種、培養條件、評價指標按1.3.5節操作，考察各因素適宜范圍。

1.3.7 菌株生長條件正交試驗

根據單因素試驗結果，采用L9（34）進行正交試驗，以雌馬酚產量為評價指標，優化生長條件。試驗中的各組平行試驗結果的差異顯著性檢驗均采用常用的統計方法F檢驗法[26]。

2 結果與分析

2.1 生長曲線的測定結果

圖1 2 株腸道菌生長曲線Fig.1 Growth curves of two intestinal bacteria

由圖1可知，2 株菌0～3 h均顯示生長相對遲緩，6～24 h菌株呈指數生長，24～39 h菌數平穩，39 h后活菌數開始減少進入衰亡期。此外圖1還顯示2 種菌在21 h之前的增殖速率基本相同，但從21 h開始進入生長平穩期間后，LJ-Q2較LJ-G1增殖速率快，39 h后LJ-Q2較LJ-G1衰亡速率快。研究結果對于后續發酵法制備雌馬酚有實際參考作用。

2.2 金屬鹽對腸道菌生長的影響

2.2.1 不同濃度金屬鹽對LJ-G1腸道菌生長的影響

圖2 不同濃度金屬鹽對LJ-G1腸道菌生長的影響Fig.2 Effect of different concentrations of salts on the growth of LJ-G1

由圖2可知，5 種金屬鹽的不同濃度對LJ-G1菌生長均有不同程度的影響，運用F檢驗的方法，對各種差異進行統計學分析得知：Na2CO3濃度在0.3 mol/L之前與對照組比其影響無顯著差異（P＞0.05），不具有統計學意義，但0.5 mol/L與0.3 mol/L相比呈明顯的抑制作用（P＜0.05）；CaCl2濃度0.1 mol/L與0.5 mol/L相比差異顯著（P＜0.05），濃度愈大抑制作用愈強，具有統計學意義；KNO3這5 個濃度的影響比較一致；ZnSO4濃度為0.3 mol/L 時抑制作用最小，0.3 mol/L分別與0.1 mol/L和0.5 mol/L相比差異顯著（P＜0.05），具有統計學意義；MnSO4濃度為0.1 mol/L時抑制作用相對較小，與0.5 mol/L相比差異顯著（P＜0.05），具有統計學意義。由圖2還可知，與對照組比較，5 種金屬鹽對LJ-G1菌生長的抑制作用由弱到強依次為Na2CO3＜CaCl2＜KNO3＜ZnSO4＜MnSO4。

2.2.2 不同濃度金屬鹽對LJ-Q2腸道菌生長的影響

圖3 不同濃度金屬鹽對LJ-Q2腸道菌生長的影響Fig.3 Effect of different concentrations of salts on growth of LJ-Q2

由圖3可知，5 種金屬鹽的不同濃度對LJ-Q2菌生長也均有不同程度的影響。運用F檢驗的方法，對各種差異進行統計學分析得知：Na2CO3對LJ-Q2菌的影響結果同于LJ-G1菌；CaCl2濃度由0.1～0.3 mol/L抑制作用顯著增強（P＜0.05），具有統計學意義；KNO3的影響與CaCl2相似；ZnSO4濃度0.1 mol/L與0.2 mol/L相比差異顯著（P＜0.05），具有統計學意義，即濃度在0.2～0.4 mol/L之間抑制作用較小；MnSO4濃度0.1 mol/L與0.2 mol/L相比差異顯著（P＜0.05），具有統計學意義，濃度在0.2 mol/L時抑制作用相對較小，其后隨濃度增大抑制作用更強。

總體來看，5 種金屬鹽對2 種產雌馬酚腸道菌的生長均有抑制作用，最強的為MnSO4。在菌的培養增殖期間應防止金屬污染。

2.3 不同碳源對腸道菌生長的影響

圖4 不同碳源對腸道菌生長的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on the growth of two intestinal bacteria

由圖4可知，5 種糖對兩株菌生長促進作用的影響從大到小依次為：葡萄糖＞麥芽糖＞乳糖＞蔗糖＞果糖，與對照組相比葡萄糖最明顯，其次是麥芽糖和乳糖。運用F檢驗的方法，對各種差異進行統計學分析，蔗糖的影響與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），不具有統計學意義，果糖的影響呈抑制作用與對照組相比差異顯著（P＜0.05），具有統計學意義，與果糖不易被微生物分解有關，這可能是蔗糖影響作用不明顯的緣故。大量體外研究表明，葡萄糖可作為腸道菌的有益碳源，而其他有害菌體不能利用或代謝利用率很低[27]，這一結果可指導在以發酵法制備雌馬酚時，添加葡萄糖作為營養物質，使產雌馬酚菌增殖提高其產量。

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 葡萄糖質量濃度對腸道菌生長的影響

圖5 不同葡萄糖質量濃度對腸道菌生長的影響Fig.5 Effect of glucose concentration on the growth of two intestinal bacteria

在pH 7、NaCl質量濃度為4 g/L 時，改變葡萄糖質量濃度分別為1、3、5、7、9 g/L，考察不同葡萄糖質量濃度對腸道菌生長的影響，結果見圖5。LJ-G1和LJ-Q2菌株菌落數在葡萄糖質量濃度為1～7 g/L時呈上升趨勢，當葡萄糖質量濃度為7 g/L時活菌數量值達到最大，此后隨質量濃度增高，活菌落數快速下降，原因是滲透壓升高，不利于菌的生長。葡萄糖對LJ-Q2菌的影響高于LJ-G1菌。

2.4.2 pH值對腸道菌生長的影響

圖6 pH值對腸道菌生長的影響Fig.6 Effect of pH on the growth of two intestinal bacteria

在葡萄糖質量濃度為7 g/L、NaCl質量濃度為4 g/L時，改變pH值分別為 4、5、6、7、8，考察pH值對腸道菌生長的影響，結果見圖6。LJ-G1和LJ-Q2菌落數在pH 4～6時呈上升趨勢，在pH值為7時達到最高，之后呈下降趨勢，可以判定菌種在pH 7時是菌落的最適生長pH值環境，本結果符合正常人體腸道內為pH 6.8～7.3之間，在此范圍選擇不同水平進行正交試驗。

2.4.3 滲透壓對腸道菌生長的影響

圖7 NaCl質量濃度對腸道菌生長的影響Fig.7 Effect of NaCl concentration on the growth of two intestinal bacteria

在葡萄糖質量濃度為7 g/L、pH值為7時，改變滲透壓（NaCl質量濃度）分別為2、4、6、8、10 g/L，考察滲透壓對腸道菌生長的影響，結果見圖7。LJ-G1和LJ-Q2活菌數隨NaCl質量濃度的升高而增大，NaCl質量濃度為4 g/L時達到最大，超過4 g/L之后活菌數明顯呈下降趨勢，且下降幅度較大。原因是隨NaCl質量濃度的繼續增高，會提高環境的滲透壓從而使菌不能繼續生長，由此可知NaCl適宜質量濃度為4 g/L左右。

從以上試驗得到兩種腸道菌3個因素最適水平范圍一致，故生長條件的優化只選擇LJ-Q2菌株進行試驗。

2.5 腸道菌生長條件的優化

表1 腸道菌生長條件L9（34）正交試驗設計方案及結果Table1 Orthogonal array design L9(34) with observed equol yield for optimization of culture conditions

由表1可知，根據極差計算得到因素主次順序為：B＞C＞A，即pH值＞ NaCl質量濃度＞葡萄糖質量濃度。計算分析因素水平優組合為A3B3C1，不同于正交試驗中指標最高的第5組A2B3C1，經驗證實驗兩組結果分別為11.52 μg/mL與11.89 μg/mL，顯著差異（P＜0.05），具有統計學意義，確定優組合為A2B3C1，即葡萄糖質量濃度7 g/L、pH 7.2、NaCl質量濃度2 g/L。

表2 方差分析表Table2 Analysis of variance

由表2方差分析可知，B因素的F值大于F臨界，這說明pH值對雌馬酚產量的影響顯著（P＜0.05）。A因素和C因素的F值均小于F臨界，這說明葡萄糖質量濃度和NaCl質量濃度對雌馬酚產量的影響不顯著。

3 結 論

通過對從素食者糞便中分離出的產雌馬酚LJ-G1 和LJ-Q2兩株菌生長特性的研究發現，生長規律為37 ℃厭氧條件下，培養6 h后進入指數期、21 h后進入生長平穩期、39 h后為衰亡期。MnSO4、ZnSO4、CaCl2、Na2CO3、KNO3對2 株菌的生長均有不同程度的抑制作用，其中MnSO4的作用最強。在對菌生長有促進作用的糖中，葡萄糖最明顯，其次是麥芽糖和乳糖。生長條件優化得出（按培養基體積計）葡萄糖質量濃度7 g/L、pH 7.2、NaCl質量濃度2 g/L，雌馬酚產量11.89 μg/mL。目前有關人體產雌馬酚腸道菌生長特性研究的相關報道幾乎未見到，今后還將依據素食者飲食特點在腸道環境方面，篩選影響產雌馬酚菌生長因素水平，進一步優化指數期和延長平穩期培養條件，為其最終實現體外采用生物發酵法制備雌馬酚奠定基礎。

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Growth Characteristics of Equol-Producing Bacterial Strains from the Intestinal Tract of Vegetarians and Optimization of Culture Conditions for Enhanced Equol Production

LI Xiao-mei, JIA Yao
(Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Two anaerobes isolated from the feces of female vegetarians, LJ-G1 and LJ-Q2, were demonstrated to capable of metabolizing soybean isof avones to produce equol. The number of colonies, optical density and equol production was plotted against culture period for either of the two strains. The impact of MnSO4, ZnSO4, CaCl2, Na2CO3and KNO3on bacterial growth was explored. Meanwhile, the utilization of different carbon sources such as lactose, maltose, sucrose, corn starch and glucose by the anaerobic strains was screened. The culture conditions for equol production were optimized by single factor and orthogonal array designs. The results showed that LJ-G1 and LJ-Q2 were preferred to grow at 37 ℃under anaerobic conditions. Their growth was at the exponential phase after 6 h of cultivation, the stationary phase after 21 h and the decline phase after 39 h. All investigated metal salts could inhibit the growth of the strains, with MnSO4being the strongest inhibitor, whereas glucose had a positive effect on the growth of these intestinal strains. The optimized culture conditions that provided a higher equol production of 11.89 μg/mL were 7 g/L glucose and 2 g/L NaCl in the medium with an initial pH of 7.2.

vegetarians; intestinal bacteria; equol

TS201.3

A

1002-6630（2014）23-0199-05

10.7506/spkx1002-6630-201423039

2014-06-25

黑龍江省自然科學基金項目（C201201）；黑龍江省高校科技創新團隊建設計劃項目（2010td04）

李笑梅（1960—），女，教授，本科，研究方向為食品科學。E-mail：lixm0451@163.com