隨機擴增多態性法分析西藏牦牛奶酪中乳酸菌的遺傳多樣性

蔣厚陽，趙國華,2，楊吉霞,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市農產品加工技術重點實驗室，重慶 400715）

隨機擴增多態性法分析西藏牦牛奶酪中乳酸菌的遺傳多樣性

蔣厚陽1，趙國華1,2，楊吉霞1,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市農產品加工技術重點實驗室，重慶 400715）

目的：利用隨機擴增多態性（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）法對西藏地區牦牛奶酪中27 株乳酸菌基因型進行同源性分析。方法：利用5 個隨機引物對Mg2+濃度、dNTP用量、退火溫度、模版用量/引物用量（ng/pmol）4 個條件做單因素梯度試驗，建立最佳反應條件，篩選最佳引物，然后對27 株乳酸菌和4 株乳酸菌標準菌株進行隨機擴增，用NTsys 2.10e軟件對擴增條帶進行聚類和遺傳相似性系數分析，分析結果與16S rRNA測序得到的菌種鑒定結果進行對比。結果：31 株菌 遺傳相似系數在0.72～1.00之間，當相似性系數在0.82時，菌株被分成了8 組，菌株按照不同種屬聚類，聚類結果同16S rRNA測序結果基本一致，同時成功將Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei兩個亞種區 分開。結論：RAPD技術可以較好地應用于西藏地區牦牛奶酪中乳酸菌親緣性關系分析。

西藏；牦牛奶酪；乳酸菌；隨機擴增多態性；聚類分析

西藏牦牛素有“高原之舟”的美稱，是我國的重要畜種。在高原地區牦牛乳及其制品是當地居民的重要食品。目前對于牦牛乳及其成分的報道日漸增多，但是對于牦牛奶酪中乳酸菌的報道卻很少。

乳酸菌作為奶酪發酵過程中的關鍵菌種，對其進行分類鑒定有著極其重要的意義。

隨機擴增多態性（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）技術最初是由美國科學家Williams[1]和Welsh[2]等運用于基因多態性分析中。它應用短的隨機引物，通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）隨機擴增后產生特異性的DNA圖譜，具有多態性高、操作簡單，引物沒有嚴格限制，可以實現高通量測定等優點。擴增圖譜重現性不高是RAPD面臨的一個問題，但是通過PCR反應程序和體系的優化，引物的篩選可以解決圖譜重現性這個問題[3-4]。目前很多國外學者將RAPD技術應用于乳酸菌基因型的研究中，如乳酸球菌屬[5]（Lactococcus）、明串珠菌屬[6]（Leuconostoc）、乳桿菌屬[7]（Lactobacillus）、腸球菌屬[8]（Enterococcus），很好地區別開親緣性較近的菌種。但是國內只有很少文獻報道了RAPD在乳酸菌基因分型中的應用。如高大威等[9]利用RAPD技術對鮮牛奶、西紅柿和酸菜中分離出的乳酸菌進行聚類分析，確定了乳酸菌間親緣性關系。秦丹[10]利用RAPD方法對四川臘肉和香腸在加工和貯藏過程中的乳酸菌進行分析，并將結果與傳統微生物培養法進行比較，兩種方法得到的結果不完全相同。

本研究通過篩選出隨機引物M13，單因素試驗獲得較好的圖譜重現性后對27 株分離純化后的乳酸菌和4 株乳酸菌標準菌株進行RAPD擴增，用NTsys 2.10e軟件對擴增后圖譜進行聚類分析，將聚類結果與各個菌株產地進行歸類對比，同時與16S rRNA序列分析后的菌種鑒定結果結果進行對比，從而探討RAPD技術在天然乳酸菌菌種分類鑒定方面的應用價值。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養基與試劑

供試菌株分離自西藏牦牛奶酪，由西藏農牧學院提供（表1）。標準菌株：Lactobacillus casei ATCC 393，Lactobacillus paracasei ATCC BAA-52，Lactobacillus plantarum ATCC 8014，Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469，購于青島海博生物技術有限公司。

表1 供試菌株Table1 Strains isolated from yak milk cheeses

續表1

MRS培養基的配制參照參考文獻[11]。

Lambda DNA/Hind Ⅲ Marker 北京鼎國生物科技有限公司；Taq酶（5 U/μL）、dNTPs（10 mmol/L）、10×酶緩沖液、MgCl2（25 mmol/L） 寶生物工程（大連）有限公司；1 kb DNA Ladder、溶菌酶、乙二胺四乙酸鈉、Tris-base、異硫氰酸胍、焦碳酸二乙酯 加拿大BBI公司；瓊脂糖 西班牙Agarose公司；蛋白酶K 美國Sigma公司；Gelred核酸染料 美國Biotium公司；細菌基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；實驗引物100 bp DNA Ladder 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HB031金屬恒溫加熱器 上海博彩生物技術有限公司；SIM-F140AY65型制冰機 三洋國際貿易有限公司；1-15PK小型臺式離心機 德國Sigma實驗室離心機公司；Biospec-mini型島津DNA/RNA/蛋白質分析裝置日本島津制作所；S1000高性能PCR儀、164-5050伯樂基礎電源電泳儀、Syngene GeneGenius 凝膠成像系統美國Syngene有限公司；GL-88B渦旋混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌DNA基因組提取

用試劑盒提取乳酸菌基因組DNA，提取DNA保存于－20 ℃冰箱中。測定提取DNA的OD260nm、OD280nm及OD260nm/OD280nm值，DNA質量濃度ρ/（μg/mL）按下式計算[12]。

ρ= OD260nm×50×n

式中：50為比例系數；n為稀釋倍數。

1.3.2 乳酸菌16S rRNA PCR

采用細菌16S rDNA基因的通用引物[13]：正向引物為27f（5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’），反向引物為1 492r（5’- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）對27 株菌提取的DNA進行擴增，擴增產物用2.0%瓊脂糖進行凝膠電泳。將擴增產物送上海生物工程有限公司測序。

1.3.3 16S rRNA序列同源性分析

登陸NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫，用BLAST軟件將16S rRNA測序結果與已知序列進行相似性分析[11]，同時對27 個菌株的測序結果采用Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean（UPGMA）法進行聚類分析，并構建各菌株的遺傳距離聚類圖。

1.3.4 RAPD隨機引物的篩選及PCR反應體系和條件的優化

隨機引物的篩選：通過對5 條不同隨機擴增引物（表2）進行PCR反應，根據條帶的多態性和亮度選擇出最適引物，進行后續單因素試驗。

表2 隨機引物編號及序列Table2 Primers of RAPD and their sequences

PCR反應體系優化：預設PCR反應體系[15]為5 U/μL Taq酶0.2 μL，10 μmol/L引物0.5 μL，模版DNA/引物用量=20，10×Taq酶緩沖液（無Mg2+）2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.6 μL。

Mg2+濃度優化：預設PCR反應體系中Mg2+濃度分別設為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L，其余試劑濃度保持不變，選擇最佳Mg2+濃度。

模版DNA/引物用量比優化：預設PCR反應體系中模版DNA/引物用量的比例分別設為5、10、20、40、80，其余試劑濃度保持不變，選擇最佳模版DNA/引物用量比例。

dNTP用量優化：預設PCR反應體系中dNTP用量分別設為30、60、90、120、150 μmol/L；其余試劑濃度保持不變，選擇最佳dNTP用量。

PCR反應條件優化：預設PCR反應程序[15]為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性1 min；50 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min；35 個循環，然后72 ℃延伸10 min。

退火溫度的優化：預設PCR反應條件中退火溫度分別設為46、47、48、49、50℃，其余條件保持不變，選擇最佳退火溫度。

PCR擴增產物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳（70 V，1 h），Gelred染色后凝膠成像。通過電泳條帶的數量、亮度、重復性和特異性條帶來確定最佳反應條件。

1.3.5 RAPD擴增產物檢測

擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。取10 μL擴增產物與2 μL Loading Buffer混勻，點樣于凝膠孔，用1 kb DNA Ladder作為分子質量標尺，電泳緩沖液為1×TAE，70 V恒壓電泳60 min，Gelred染色后通過凝膠成像系統拍照。

1.3.6 RAPD 譜帶分析

各菌株的擴增圖譜上特定位點無條帶的賦值為0，有條帶的賦值為1，用NTsys 2.10e制作為“0，1”文件，采用UPGMA法進行聚類分析，并構建各菌株的遺傳距離聚類圖。

2 結果與分析

2.1 DNA提取和PCR擴增電泳圖及16S rRNA序列同源性分析結果

圖1 DNA電泳圖（a）和16S rRNA片段擴增圖（b）Fig.1 Electrophoresis of genomic DNA (a) and 16S rRNA amplification products (b)

圖1a顯示了27 株菌的DNA提取結果，OD260nm/ OD280nm的范圍在1.8～2.2之間，在23 000 bp處有明顯的單一條帶。圖1b顯示了27 株菌16S rRNA的PCR擴增結果，在1 500 bp處有明顯的單一條帶。說明各菌株基因組DNA均被成功提取出，同時成功擴增出目標片段。

圖2 27株菌的16S rRNA系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 27 strains based on 16S rRNA

由圖2可知，27 株菌分為6 個大的分支，其中21-1、16-4、17-1、26-1、15-1、21-2、123-4、12-2、122-1、20-1、13-3、23-3、11-2、24-3、12-1、02-1、14-3、19-2位于一個分支，屬于Lactobacillus casei或者Lactobacillus paracasei。125-2處于一個分支，屬于Lactobacillus parabuchneri。16-1、16-2、19-1位于一個分支，屬于Lactobacillus diolivorans。17-5、28-1、20-2位于一個分支，屬于Lactobacillus plantarum。14-1位于一個分支，屬于Lactobacillus helveticus。123-2位于一個分支，屬于Leuconostoc mesenteroides。圖中未能將Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei分開。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 退火溫度

圖3 不同退火溫度下菌株23-3的RAPD擴增圖譜Fig.3 Influence of PCR annealing temperature on RAPD profiles of strains 23-3

由圖3可知，退火溫度由46 ℃升到48 ℃過程中，條帶的亮度逐漸增加，溫度由48 ℃升到50 ℃的過程中，條帶的亮度和數量保持不變，同時條帶整體重現性較好，考慮到退火溫度較低時引物與模版結合更好，所以PCR反應中退火溫度選用48 ℃。

2.2.2 模版DNA/引物用量比

圖4 不同模版DNA/引物用量對菌株23-3 RAPD擴增圖譜的影響Fig.4 Influence of DNA template/primer ratio on RAPD profiles of strains 23-3

由圖4可知，電泳條帶的整體重現性很好，在模板DNA/引物用量比為5和10的情況下出現5 個條帶，同時考慮到在用量比為10情況下條帶亮度更佳，所以25 μL PCR反應體系模版DNA/引物用量比選用10。

2.2.3 Mg2+濃度

圖5 不同Mg2+濃度對菌株23-3 RAPD擴增圖譜的影響Fig.5 Influence of Mg2+concentration on RAPD profiles of strains 23-3

由圖5可知，電泳條帶整體重現性很好，隨著Mg2+濃度的升高，條帶的亮度逐漸增加，在Mg2+濃度為3.0 mmol/L時效果最佳，所以25 μL PCR反應體系中Mg2+的濃度選用3.0 mmol/L。

2.2.4 dNTP用量

圖6 不同dNTP用量對菌株23-3 RAPD擴增圖譜的影響Fig.6 Influence of dNTP amount on RAPD profiles of strains 23-3

由圖6可知，隨著dNTP用量的增加條帶的亮度顯著增加，在150 μmol/L時達到最亮，同時條帶整體重現性較好，在150 μmol/L條件下達到了7 條，所以25 μL PCR反應體系中dNTP用量選用150 μmol/L。經過單因素試驗，得到優化的RAPD擴增程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性1 min；48 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min；35 個循環，然后72 ℃延伸10 min。優化的PCR反應體系為：25 μL總反應體積，模版DNA/引物用量=10，10×Taq酶緩沖液（無Mg2+）2.5 μL，25 mmol/L MgCl23.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL，10 μmol/L引物0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，滅菌純水補至25 μL。對4 株乳酸菌標準菌株和27 株分離乳酸菌進行RAPD擴增。

2.3 整體乳酸菌RAPD圖譜

由圖7可知，27 株西藏牦牛奶酪分離乳酸菌和4 株乳酸菌標準菌株用M13引物擴增并電泳后，所有菌株均擴增出明顯的條帶，同時16S rRNA鑒定出相同屬的菌株之間可以看出明顯的相似性，各個菌株之間也存在特異性，擴增出的條帶數目在3～10 條之間，所獲得的片段分子質量大小在250～3 000 bp之間。

圖7 牦牛奶酪中31株乳酸菌的RAPD擴增圖譜Fig.7 RAPD profiles of 31 strains isolated from yak milk cheeses

2.4 聚類分析結果

圖8 31 株乳酸菌親緣關系聚類樹狀圖Fig.8 Cluster dendrogram generated from similarity coefficient matrix of 31 lactic acid bacteria

用NTsys2.10e軟件，按照UPMGA法，對供試菌株之間的遺傳相似系數矩陣進行聚類分析，得到聚類分析圖。由圖8可知，當相似性系數為0.82時，分離自牦牛奶酪的27 株乳酸菌和4 株乳酸菌標準菌株被分成了8 個組。第一組包括11-2、122-1、12-2、21-1、23-3、21-2、24-3、15-1、13-3、02-1、12-1、19-2、14-3、17-1和casei標準菌株，它們都是Lactobacillus casei。第二組只有一支菌123-2，為Leuconostoc mesenteroides。第三組中16-1、16-2、19-1聚為第一分支，它們是Lactobacillus diolivorans。另一分支為125-2，是Lactobacillus parabuchneri，Lactobacillus rhamnosus單獨成為一個分支。第四組只有一支菌14-1，為Lactobacillus helveticus。第五組中paracasei標準菌株單獨成為一分支，26-1和123-4聚為另一分支，為Lactobacillus paracasei。第六組只有一支菌16-4，為Lactobacillus casei。第七組只有一支菌20-1，為Lactobacillus casei。第八組包括17-5、28-1、20-2和plantarum標準菌株，它們都是Lactobacillus plantarum。通過聚類分析圖和16S rRNA測序結果之間的相互比較可以發現RAPD聚類分析結果同16S rRNA測序結果基本一致，但是16S rRNA 進化樹圖并不能夠將Lactobacillus paracasei和Lactobacillus casei兩個亞種區分開，而利用RAPD聚類分析結果可以將其區分開。由此可以得出在乳酸菌基因型分類鑒定中，RAPD對于親緣型很近菌株的鑒定效果要優于16S rRNA同源性分析，更適合于西藏牦牛奶酪中乳酸菌親緣性關系分析。

3 討 論

西藏地區居民主要采用傳統手工方法制作奶酪，由于產地、乳酸菌種、制作工藝的不同，導致奶酪風味和質地的多樣化。乳酸菌又是奶酪制作過程中的核心，是奶酪品質好壞的關鍵。建立系統的鑒定方法對奶酪中乳酸菌進行分析，會對當地奶酪制品質量的提高起到很大的借鑒作用。

目前對于細菌的鑒定主要有表型鑒定和基因型鑒定兩種方法。表型鑒定不僅在操作上具有一定的復雜性，同時在鑒定的水平上只能達到屬的水平，難以達到種水平的鑒定[16]。而RAPD技術運用隨機引物對不同種群的基因組DNA進行擴增，不僅可以在分子水平上對菌株之間進行分類和鑒定，還可以整體基因組DNA進行多態性檢測，同時操作簡易，準確性高。許多國外學者已經成功地將RAPD技術應用于乳酸菌的分離鑒定。如Gevers等[17]運用隨機引物（GTG）5成功地完成對干香腸中乳桿菌亞種的分類和鑒定。Corroler等[18]運用RAPD技術對不同季節采集的牛奶中L. lactis subsp. lacti和L. lactis subsp. cremoris兩個亞種進行分類和鑒定。Cocconcelli等[19]運用RAPD技術區分開嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）、瑞士乳桿菌（L. helveticus）、干酪乳桿菌（L. casei）、植物乳桿菌（L. plantarum）、糞腸球菌（Ent. faecalis）、屎腸球菌（Ent. faecium）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）等菌株。Nigatu等[20]利用RAPD技術對45株乳桿菌進行區分，所有菌株均擴增出了不同的多態性條帶，并且相似度在72%以上，對乳桿菌屬進行了最集中和廣泛的研究。

根據決策對象、決策指標、聚類結果建立決策表，令決策表DT=(U,P∪D)，子集D=g0gggggg為決策屬性集，子集P={aj|j=1,2,…,m}為條件屬性集，U={i|i=1,2,…，n}為論域，aij表示決策對象i在條件屬性aj上的值。

本研究利用16S rRNA和RAPD技術對西藏牦牛奶酪中乳酸菌的基因型和遺傳多樣性進行了分析，用NTsys 2.10e軟件計算出了31 株乳酸菌菌株之間的遺傳相似系數矩陣，并用UPMGA法作聚類分析圖，與16S rRNA序列分析結果相對比。在與16S rRNA序列分析結果的比較中，兩種基因型方法得出的結果基本是一致的。同時在RAPD的聚類圖中將L. casei和L. paracasei這兩個亞種有效地區分開來，這是16S rRNA技術在進行同源性分析時做不到的，同時相關文獻中也無類似報道。綜合比較結果考慮，RAPD技術在乳酸菌分類鑒定中有一定的應用價值，同時它有操作簡單快速、種間和種內區分效率高、費用低的優勢，與其他表型和基因型方法相結合，可提高菌種鑒定效率和準確性。

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Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis of Lactic Acid Bacteria from Yak Milk from Tibet Area

JIANG Hou-yang1, ZHAO Guo-hua1,2, YANG Ji-xia1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Key Laborat ory of Agricultural Product Processing, Chongqing 400715, China)

Objective: This study analyzed the homology of 27 strains of lactic acid bacterial genotype from Tibetan yak cheese by randomly amplif ed polymorphic DNA (RAPD) method. Methods: To establish a reliable RAPD protocol with 5 primers, the optimal primers and PCR conditions for the quality and reproducibility of RAPD prof les were investigated, including Mg2+concentration, dNTP amount, annealing temperature, and DNA template/primer ratio. The optimal PCR procedure and reaction reagent concentration were employed for RAPD amplif cation of 27 isolates from yak milk cheeses and 4 standard strains of lactic acid bacteria. Electrophoretic profiles were analyzed by NTsys 2.10e software, genetic similarity coeff cients were calculated and a cluster dendrogram was plotted. Results: Genetic similarity coeff cients of 31 strains ranged from 0.72 to 1.00. The cluster dendrogram showed that 31 isolates were classif ed into 8 groups using the similarity coeff cient of 0.82 as a cut-off point. The group discrimination corresponded well with the species assignment by 16S rRNA sequence analysis, and Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei were separated successfully. Conclusion: The RAPD technique was useful for relationship analysis of lactic acid bacteria isolated from Tibetan yak milk cheeses.

Tibet; yak milk cheese; lactic acid bacteria; randomly amplif ed polymorphic DNA (RAPD); cluster analysis

TS252.54

A

1002-6630（2014）23-0215-06

10.7506/spkx1002-6630-201423042

2013-12-19

西南大學博士啟動基金項目（SWU113035）；中央高校基本科研業務費專項資金項目（XDJK2009C039）

蔣厚陽（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：rxxlcool@126.com

*通信作者：楊吉霞（1978—），女，講師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：yangjx@188.com