γ-氨基丁酸產生菌的篩選及培養基優化

徐林敏，張 充，陸兆新，別小妹，趙海珍，呂鳳霞

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

γ-氨基丁酸產生菌的篩選及培養基優化

徐林敏，張 充，陸兆新，別小妹，趙海珍，呂鳳霞*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

采用紙層析法對南京地區多個不同場所采集的土樣進行了菌種分離純化，篩選到一株產γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的菌株X-1，經形態特征與16S rDNA序列分析鑒定為巨大芽孢桿菌。通過單因素和正交試驗對其發酵培養基進行優化，得到最佳培養基成分為葡萄糖30.0 g/L、蛋白胨30.0 g/L、K2HPO40.6 g/L、磷酸吡哆醇0.3 g/L、L-谷氨酸鈉10.0 g/L、NaNO33.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L。在此條件下，GABA濃度可達21.57 mmol/L，比優化前GABA濃度提高了3.83 倍。

γ-氨基丁酸；篩選；培養基優化

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA，也稱氨酪酸）廣泛分布于動植物中，是人和動植物體中一種非常重要的非蛋白質氨基酸。GABA不僅是動物中樞神經系統中有效的抑制性神經遞質，有鎮靜、降血壓、抗驚厥、癲癇、增進腦活力、營養神經細胞、促進生長激素分泌、保肝利腎等生理作用[1-6]，還在非神經的組織中發揮激素或營養因子的功能，對動物機體正常的生理功能起著重要的調節作用[7-8]，因而其在功能性食品及醫藥領域具有良好的應用前景。2009年，GABA被批準為新資源食品，目前GABA在食品工業中已廣泛地應用于飲料、乳制品、烘焙食品等制品中[9-10]。

生物合成GABA的關鍵酶是谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD），其催化L-谷氨酸的α-脫羧反應，生成GABA。該酶在低等生物 和高等生物中都可發現。微生物因其生長速度快、生長條件簡單、發酵成本低等特點。因此，利用微生物中的GAD催化谷氨酸生產GABA，不受資源、環境和空間的限制，相對于復雜的植物富集和存在安全性問題的化學合成，具有顯著的優點[11]。

目前已在多種微生物中發現了GAD的存在，如大腸桿菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌等[12]，但這些微生物的GAD活力普遍不高，且為胞內酶，GAD的提取純化困難，不利于工業化生產。尤其，大腸桿菌發酵后會產生內毒素，存在安全性問題[13]。芽孢桿菌作為一種新的有潛在藥用價值化合物的產生菌[14]，自1971年首次報道產GABA以來，研究甚少。本實驗從土壤中篩選高產GABA的芽孢桿菌，對其進行菌種鑒定，并采用單因素和正交試驗對其發酵培養基進行優化，旨在探討影響芽孢桿菌產γ-氨基丁酸的諸因素，以提高GABA的濃度，為今后工業化生產GABA提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

樣品采集于土壤，采樣于江蘇省南京市紫金山、南京郊區奶廠和南京生態果園。

1.1.2 培養基

種子培養基：馬鈴薯200 g/L（切片水煮30 min，過濾取汁），葡萄糖20 g/L，pH值自然，115 ℃、30 min滅菌備用，固體培養基另加15.0～20.0 g/L的瓊脂。

基礎發酵培養基：葡萄糖30.0 g/L、酵母浸膏1.0 g/L、NaNO33.0 g/L、K2HPO41.0 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、L-谷氨酸鈉5.0 g/L，調節pH值至6.0，于115 ℃、30 min滅菌備用。

1.1.3 試劑

γ-氨基丁酸（含量≥9 9%）、磷酸吡哆醛（pyrodoxal-5-phosphate，PLP） 美國Sigma公司；L-谷氨酸鈉（L-monosodium glutamate，L-MSG，含量≥99%） 江蘇菊花味精集團有限公司；甲醇、四氫呋喃、丙酮（均為色譜純） 美國Tedia公司；丹磺酰氯（dansyl chloride，DNS-Cl） Flukahcemei公司；細菌總DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產分析純級試劑，水為自制超純水。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100 Series高效液相色譜（VWD檢測器） 美國Agilent公司；EUTECH pH510酸度計美國Eutech公司；Centrifuge 5804R冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；HT6029超凈工作臺 蘇州進化設備有限公司；BL-220H電子精密天平 日本島津公司；PTC-100TM PCR儀 美國MJ Research公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選

稱取10 g采集的樣品，放入盛有100 mL生理鹽水和玻璃珠的250 mL三角瓶中，于30 ℃、180 r/min培養30 min。將樣品用滅菌生理鹽水進行遞度稀釋涂布于PDA固體培養基中，30 ℃培養箱倒置培養72 h。挑取單菌落接入含5.0 g/L L-谷氨酸鈉的發酵液中按30 ℃、180 r/min進行搖瓶發酵72 h。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 定性檢測

采用紙層析法。展開劑：V（正丁醇）∶V（冰醋酸）∶V（水）=4∶1∶3，內含質量濃度為4 mg/mL的水合茚三酮。以γ-氨基丁酸標準品作為對照，取發酵液上清液5 μL進行點樣，層析3.5 h后將濾紙放于85 ℃烘箱中顯色5 min，觀察是否有GABA斑點。

1.3.2.2 定量分析

采用高效液相色譜法。將離心后的發酵上清液用0.2 mol/L（pH 9.8）的NaHCO3緩沖液稀100 倍，然后取20 μL，加入等量的（4 g/L）DNS-Cl丙酮溶液，置37 ℃條件下避光衍生化反應，用Agilent 5 HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速0.6 mL/min，254 nm檢測。流動相A為甲醇、B為乙酸鈉緩沖液，梯度洗脫。洗脫時，流動相B的比例為：0～8 min，20%；8～25 min，20%～50%；26～34 min維持100%；35～50 min，返回20%[15]。

1.3.3 菌株鑒定

1.3.3.1 形態特征鑒定

按照參考文獻[16]進行。

1.3.3.2 16S rDNA的擴增與測序

采用細菌總DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用細菌的16S rDNA通用引物進行PCR擴增。正向引物F1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物R1：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反應體系（總體積50 μL）：10×PCR緩沖液5 μL；正、反向引物F1、R1 均為10 mmol/L各2.5 μL；dNTP（10 mmol/L）4 μL；基因組DNA1.0 μL；TaqDNA聚合酶0.5 μL；雙蒸水34.5 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸3 min，共進行30 個循環；再72 ℃延伸10 min。PCR產物測序由南京金思瑞生物技術公司完成。

1.3.3.3 序列比對及系統發育分析

將16S rDNA序列與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數據庫中的核苷酸序列進行同源性分析。選擇同源性較高及已報道產GAD的細菌16S rDNA核苷酸序列，利用Clustalx2.0進行多重聯配，然后再利用MEGA5.0軟件采用鄰接（Neighbour-Joining）方法以E.coli O157∶H7為外群（out-group）構建系統發育樹，并進行Bootstrap分析。

1.3.4 培養基成分優化

1.3.4.1 不同碳源對GABA發酵的影響

分別以30.0 g/L的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作為碳源作進行發酵實驗，測定發酵液中GABA濃度，從而篩選出最佳的碳源。

1.3.4.2 碳源質量濃度對GABA發酵的影響

分別向基礎發酵培養基中添加10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 g/L的葡萄糖，30 ℃、180 r/min搖瓶發酵72 h，測發酵液中GABA濃度，確定合適的葡萄糖質量濃度。

1.3.4.3 不同氮源對GABA發酵的影響

分別向基礎培養基中添加10.0 g/L的牛肉膏、蛋白胨、玉米浸膏、黃豆粉和酵母浸膏，篩選有機氮源。再以篩出的有機氮源與3.0 g/L NaNO3、尿素、磷酸氫二銨、硫酸銨分別組成復合氮源，測定發酵液中GABA濃度，確定最佳的氮源組成。

1.3.4.4 氮源質量濃度對GABA發酵的影響

分別向基礎發酵培養基中添加10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 g/L的蛋白胨，30 ℃、180 r/min搖瓶發酵72 h，測發酵液中GABA濃度，確定合適的蛋白胨質量濃度。再以最佳蛋白胨質量濃度為基礎，別向發酵培養基中添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L的NaNO3，30 ℃、180 r/min搖瓶發酵72 h，測發酵液中GABA濃度，確定合適的NaNO3質量濃度。

1.3.4.5 L-谷氨酸鈉質量濃度對GABA發酵的影響

在基礎發酵培養基中分別加入5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L的L-谷氨酸鈉，確定最適的底物質量濃度。

1.3.4.6 無機鹽及生長因子對GABA發酵的影響

選取K2HPO4、MgSO4、CaCl2、生物素和PLP，分別在基礎發酵培養基中按不同質量濃度添加，確定最佳無機鹽和生長因子。

1.3.4.7 正交試驗優化

經單因素試驗，篩選出發酵培養基中添加葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、PLP和L-MSG 5 種物質，設定五因素三水平試驗，確定最佳培養基成分。

2 結果與分析

2.1 GAD產生菌的篩選

2.1.1 初篩

從南京市紫金山、南京郊區奶廠和南京生態果園的土壤中分離出487 株菌，對這些菌株進行搖瓶發酵，篩選出3 株有茚三酮顯色斑點，菌株編號為X-1、X-2、X-3，結果見圖1。

圖1 發酵液紙層析圖Fig.1 Paper chromatography of the fermented broth

2.1.2 復篩

圖2 GABA標品（a）及發酵液（b）的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of GABA standard (a) and the fermented broth (b)

采用高效液相色譜法對有顯色斑點的菌株進行復篩，以確定待測菌株發酵液中GABA濃度。HPLC譜圖如圖2所示。以峰面積（y）對GABA質量濃度（x）作線性回歸，制作GABA標準曲線，GABA質量濃度在0～5 g/L內的標準曲線為y=871.55x+314.16（R2=0.998 6）。GABA的定量分析結果見表1。其中菌株X-2的發酵液中GABA濃度最高，達（17.19±0.09）mmol/L，但經驗證X-2為革蘭氏陰性菌、無芽孢，故不再進行后續研究。而菌株X-1為芽孢桿菌，其發酵液中GABA的濃度為4.46 mmol/L，選取該菌株進行后續研究。

表1 GABA產生菌篩選結果Table1 Screening of GABA-producing strains

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株X-1形態特征

在PDA固體培養基中培養18 h，菌株X-1菌體短橢圓狀，染色均勻、革蘭氏染色陽性，芽孢近端生、圓形。初步判斷菌株X-1屬于芽孢桿菌屬。

2.2.2 分子生物學鑒定

對菌株X-1的16S rDNA進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，測序核苷酸序列為1 080 bp，GenBank登記號為NR074290。經與GenBank+EMBL+D DBJ+PDB數據庫中報道的16S rDNA核苷酸序列比對，結果顯示菌株X-1的16S rDNA核苷酸序列與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）的16S rDNA核苷酸序列的同源性最高，達到99%。構建Neighbor-Joining系統進化樹 如圖3所示，菌株X-1的16S rDNA與已知的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）聚在一個分支上，相似性為100%。

結合X-1的形態特征和16S rDNA序列分析，菌株X-1鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

圖3 以16S rDNA序列為基礎的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA

2.3 B. megaterium X-1生長曲線和產酶曲線

對B. megaterium X-1進行搖瓶振蕩培養，測定菌體OD600nm和發酵液中GABA濃度隨時間的變化情況，結果如圖4所示。B. megaterium X-1在2 h進入對數生長期，生長到12 h時菌體生長達到最高，12 h后進入穩定期，而GABA在發酵24 h后才開始產生，這可能是由于GABA的產生與巨大芽孢桿菌芽孢的形成有關[17]。

圖4 B. megaterium X-1的生長曲線及GAB A濃度Fig.4 Growth curve and GAB A production of B. megaterium X-1

由圖4可知，當菌體進入穩定期后，隨著發酵時間的延長，GABA濃度逐漸提高，這種類型的合成方式在酶生物合成的模式中屬于滯后合成型，該類酶所對應的mRNA穩定性較好，可以在細胞生長進入穩定期后相 當長的一段時間內，繼續進行酶的生物合成。考慮到隨發酵時間延長，生產周期也延長，生產成本增加，所以確定72 h為B. megaterium X-1產GABA的發酵時間。

2.4 培養基組分優化

2.4.1 不同碳源對GABA發酵的影響

圖5 碳源對B. megaterium X-1產-氨基丁酸的影響Fig.5 E ffect of carbon sources on the production of GABA

不同碳源對B. megaterium X-1產GABA濃度影響，結果如圖5所示，添加葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、蔗糖5 種碳源中，葡萄糖在提高發酵液中GABA濃度最顯著，GABA濃度為4.46 mmol/L。因此，選擇葡萄糖為培養基的碳源。

2.4.2 葡萄糖質量濃度對GABA發酵的影響

圖6 不同質量濃度葡萄糖對B. megaterium X-1產-氨基丁酸濃度的影響Fig.6 Effe ct of glucose concentration on the production of GABA

由圖6可知，當培養基中葡萄糖質量濃度為30.0 g/L時，發酵 液中GABA濃度最高，為4.46 mmol/L。但隨著葡萄糖添加量提高，GABA濃度逐漸降低。因此選擇葡萄糖的添加量為30.0 g/L。

2.4.3 不同氮源對GABA發酵的影響

圖7 不同氮源對B. megaterium X-1產-氨基丁酸濃度的影響Fig.7 Effect of nitrogen sources on the production of GABA

圖8 不同復合氮源對B. megaterium X-1產-氨基丁酸濃度的影響Fig.8 E ffect of mixed nitrogen sources on the the production of GABA

不同氮源對B. megaterium X-1產GABA濃度影響，結果如圖7所示。在單一氮源的實驗中，蛋白胨作為唯一氮源時GABA濃度最高，為3.15 mmol/L。這也與Sun Baishen等[18]研究相一致。而在培養基中加入3.0 g/L NaNO3、尿素、磷酸氫二銨、硫酸銨組成復合氮源時，結果如圖8所示，NaNO3與蛋白胨組成復合氮源時，GABA濃度最高，為4.68 mmol/L。其他無機氮源效果不明顯，故培養基選用蛋白胨與NaNO3組成復合氮源。

2.4.4 氮源質量濃度對GABA發酵的影響

圖9 不同質量濃度蛋白胨對B. megaterium X-1產-氨基丁酸濃度的影響Fig.9 Effect of peptone concentration on the production of GABA

由圖9可知，當培養基中蛋白胨質量濃度為30.0 g/L時，發酵液中GABA濃度最高，為6.60 mmol/L。隨著蛋白胨添加量增加，GABA濃度逐漸降低。 因此選擇蛋白胨添加量為30.0 g/L。

圖 10 不同質量濃度NaNO3對B. megaterium X-1產y-氨基丁酸濃度的影響Fig.10 Effect of NaNO3concentration on the production of GABA

以30.0 g/L葡萄糖為碳源，30.0 g/L的蛋白胨為有機氮源，探討不同質量濃度的NaNO3對B. megaterium X-1發酵產GABA的影響如圖10所示，NaNO3質量濃度為3.0 g/L效果最好，為7.53 mmol/L。當NaNO3質量濃度在1.0～2.0 g/L時，發酵液中GABA濃度逐漸增加，當NaNO3質量濃度在3.0～5.0 g/L時，GABA濃度逐漸下降。這可能是由于NaNO3作為速效氮源，在發酵過程中適量的NaNO3有利于菌體快速利用氮源，達到較高的生物量。但過多的NaNO3對于細菌的生長及GABA的產生有一定的抑制作用，且NaNO3在作用過程中對GABA濃度的影響不明顯，故不將其考慮在正交試驗中。

2.4.5 L-谷氨酸鈉對GABA發酵的影響

L-谷氨酸鈉在發酵過程中既是GABA生成的底物，又可為菌體生長提供氮源[19]。不同質量濃度L-谷氨酸鈉的添加對發酵液中GABA濃度影響，如圖11所示。當L-谷氨酸鈉質量濃度在5.0～10.0 g/L時，發酵液中GABA濃度逐漸增加，當L-谷氨酸鈉質量濃度為10.0 g/L時，發酵液中GABA濃度最高，為7.55 mmol/L。當L-谷氨酸鈉質量濃度高于10.0 g/L時，GABA濃度有所下降，說明L-谷氨酸鈉質量濃度對GABA濃度影響明顯。

圖 11 不同質量濃度L-谷氨酸鈉對B. megaterriiuumm X-1產γ-氨基丁酸濃度的影響Fig.11 Effect of monosodium glutamate concentration on the production of GABA

2.4.6 無機鹽及生長因子對GABA發酵的影響

圖 12 無機鹽（a）及生長因子（b）對B. megateriiuumm X-1產γ--氨基丁酸濃度的影響Fig.12 Effect of inorganic salts (a) and growth factors (b) on the the production of GABA

在基礎培養基中分別加入0～1.2 g/L的K2HPO4、MgSO4、CaCl2與0.1～0.5 g/L的生物素和PLP，探討無機鹽對B. megaterium X-1發酵產γ-氨 基丁酸的影響，結果如圖12所示，MgSO4、CaCl2和生物素對GABA濃度的提高效果不明顯，而K2HPO4和PLP在一定質量濃度下能明顯提高發酵液中GABA濃度，這與孟和畢力格[20]、Komatsuzaki[21]等的研究成果一致，故將K2HPO4和PLP作為正交試驗的兩個因素進行后續討論。

2.4.7 正交試驗優化

通過單因素試驗，篩選葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、L-MSG和PLP 5 個主要影響因素，采用三水平五因素L16（35）正交試驗對培養基組分進行優化，結果及分析如表2、3所示。

表2 培養基組分的正交試驗方案及結果Table2 Orthogonal array design with experimental results

表3 正交試驗結果方差分析Table3 Analysis of variance (ANOVA) of the experimental results from orthogonal array design

從表2、3可以反映出各因素對發酵液中GABA產量的影響主次順序是B＞A＞E＞C＞D，即培養基中蛋白胨對GABA濃度影響最顯著，葡萄糖、PLP和KH2PO4次之，L-MSG添加量沒有顯著性影響。由表2可知，5 個因素的最佳組合為A2B2C2D1E3。確定B. megaterium X-1最佳發酵培養基成分為A2B2C2D1E3，即葡萄糖30.0 g/L、蛋白胨30.0 g/L、KH2PO40.6 g/L、L-MSG 10.0 g/L、PLP 0.3 g/L、NaNO33.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L。在此條件下重復發酵3 次，GABA濃度可達（21.57±1.23） mmol/L，比優化前（4.46 mmol/L）提高3.83 倍。

3 結論與討論

本實驗從土壤中分離出一株產GABA的芽孢桿菌菌株X-1，經形態特征與16S rDNA鑒定為巨大芽孢桿菌（B. megaterium）。1976年Foerster等[22]研究發現在B. megaterium芽孢休眠過程中不存在GABA，當芽孢開始萌發后，GABA含量開始增加，表明GAD與芽孢的萌發有關，而本研究 B. megaterium X-1在發酵12 h后進入穩定期，芽孢開始萌發，發酵液中GABA濃度開始增加，并隨著發酵時間的延長，GABA濃度持續增加。這與Foerster等[22]的研究相一致，而與楊勝遠等[23]研究的B. megaterium EJC-1培養6 h進入對數生長期，40 h后進入穩定 期，50 h后進入衰亡期而有所不同，說明不同來源的菌種其生產周期和培養特性有所不同。

雖然早在1971年就已發現B. megaterium中存在GAD，但有關B. megaterium產GABA發酵工藝的研究也未見報道。本研究通過單因素試驗和正交試驗對B. megaterium X-1的培養基成分進行優化，確定了B. megaterium X-1最佳發酵培養基成分。在此條件下，發酵液中GABA濃度可達21.57 mmol/L，比優化前提高了3.83 倍，優化效果十分明顯。同時，在B. megaterium X-1的培養基優化研究過程中也發現，PLP作為GAD的 輔酶，對提高B. megaterium X-1發酵產GABA濃度效果顯著，這與Coda等[24]的研究結果類似，究其原因可能PLP作為GAD的輔酶，與酶蛋白結合而增強GAD活性，從而提高發酵液中GABA濃度。但考慮其成本較高，且對光、O2較為敏感，有待進一步探討PLP成分的替代品。

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Screening of Gamma-Aminobutyric Acid-Producing Bacterium and Medium Optimization

XU Lin-min, ZHANG Chong, LU Zhao-xin, BIE Xiao-mei, ZHAO Hai-zhen, Lü Feng-xia*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

A γ-aminobutyric acid (GABA)-producing strain X-1 was isolated from soil samples by paper chromatography. Based on morphological characteristics, and 16S rDNA sequence and phylogenic analyses, X-1 was identified as Bacillus megaterium. The culture medium of Bacillus megaterium X-1 was studied by single factor and orthogonal array designs. The optimal medium components were 30.0 g/L glucose, 30.0 g/L peptone, 0.6 g/L K2HPO4, 0.3 g/L pyrodoxal-5-phosphate, 10.0 g/L monosodium glutamate, 3.0 g/L NaNO3, 0.5 g/L MgSO47H2O, and 0.01 g/L FeSO47H2O. Using the optimized medium, the highest GABA yield of 21.57 mmol/L was obtained, representing a 4.83-fold increase over that before optimization.

γ-aminobutyric acid; screening; culture medium optimization

Q939.9

A

1002-6630（2014）23-0238-07

10.7506/spkx1002-6630-201423046

2014-09-03

徐林敏（1990—），女，碩士研究生，主要從事食品生物技術研究。E-mail：2012108004@njau.edu.cn

*通信作者：呂鳳霞（1963—），女，教授，博士，主要從事酶工程研究。E-mail：lufengxia@njau.edu.cn