黑靈芝多糖對小鼠腹腔巨噬細胞甘露糖受體的影響

帥小雪，李文娟，劉丹鳳，王玉婷，朱科學，謝明勇

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

黑靈芝多糖對小鼠腹腔巨噬細胞甘露糖受體的影響

帥小雪，李文娟，劉丹鳳，王玉婷，朱科學，謝明勇*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

目的：研究黑靈芝多糖（polysaccharides from Ganoderma atrum，PSG-1）對體外培養的小鼠腹腔巨噬細胞甘露糖受體（mannose receptor，MR，CD206）的影響。方法：不同質量濃度的PSG-1作用巨噬細胞后，用流式細胞儀測定細胞表面MR的表達，反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測巨噬細胞MR的mRNA表達水平；以MR抑制劑甘露聚糖預處理細胞后加入PSG-1，用流式細胞儀檢測巨噬細胞的吞噬功能，酶聯免疫法測定培養上清液中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的含量，RT-PCR檢測細胞TNF-α、IL-1β的mRNA表達水平。結果：PSG-1可上調巨噬細胞表面MR的表達及MR mRNA水平；與單獨PSG-1處理組相比，甘露聚糖預處理可明顯抑制PSG-1增強的巨噬細胞吞噬功能和誘導細胞分泌IL-1β，對TNF-α的分泌則無影響。結論：MR能部分介導PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞的免疫調節作用。由此推測，MR可能是PSG-1發揮調節免疫作用的受體之一。

黑靈芝多糖；巨噬細胞；甘露糖受體；吞噬功能；細胞因子

黑靈芝既是我國傳統的藥用真菌也是民間常見的食品配料，它具有多方面的生物活性。研究表明食用黑靈芝可補腎強精、延緩衰老、增強免疫力，對腫瘤、炎癥、糖尿病等有很好的療效[1]。現代研究認為，從黑靈芝中提取的水溶性成分黑靈芝多糖是黑靈芝生物學作用的主要功效成分[2]。多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗輻射、降血糖、降血脂、保肝等多種功能[3]，其中多糖的免疫調節作用是多糖類物質的最基本作用，研究發現多糖激活免疫細胞發揮免疫調節作用是通過與細胞表面的受體相結合而介導免疫反應[4]。

甘露糖受體（mannose receptor，MR，CD206）屬于C型凝集素樣受體，是鈣依賴性Ⅰ型跨膜蛋白受體，可識別和結合以D-甘露糖、L-巖藻糖和N-乙酰葡萄糖胺等糖殘基為末端的糖類物質[5]。本實驗室從黑靈芝中分離純化出一種由甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成的水溶性黑靈芝多糖（polysaccharides from Ganoderma atrum，PSG-1），3 種單糖的物質的量比為1∶1.28∶4.91[6]。前期研究已證明PSG-1具有調節小鼠腹腔巨噬細胞免疫功能的作用[7]，甘露糖作為PSG-1的三大組分之一，提示PSG-1與MR具有潛在的結合能力。但是PSG-1對機體免疫的調節作用是否與MR結合有關，含有甘露糖的PSG-1是否可作為MR的候選配體從而激活細胞內信號通路，調節機體免疫功能，這些內容仍有待進一步的研究。因此，在前期研究的基礎上，本實驗采用體外培養小鼠腹腔巨噬細胞，研究PSG-1對巨噬細胞MR的影響及其是否通過MR影響細胞的吞噬功能和細胞因子的分泌。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

BALB/c清潔級小鼠，雌性，體質量（22±2）g，購自南昌大學醫學院動物房；水溶性黑靈芝多糖PSG-1（純度＞99.8%）由本實驗室自制。

RPMI-1640培養基 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清 美國HyClone公司；甘露聚糖 美國Sigma公司；FITC-大鼠抗小鼠CD206抗體 英國AbD Serotec公司；異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖（FITC-dextran）美國Sigma公司；反轉錄試劑盒 美國Fermentas公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 北京全式金公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

Varioskan Flash多功能酶標儀 美國Thermo公司；3K15-高速冷凍離心機 美國Sigma 公司；FACSCaliburTM流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；MyCycler PCR擴增儀、ChemiDoc XRS+凝膠顯像系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離、純化及培養

小鼠分籠飼養于空調溫室內，溫度（22±2）℃，相對濕度50%～60%，自動調控晝夜各12 h，飼料喂養，自由飲水，實驗前靜養1 周。小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇中浸泡3～5 min，取出小鼠，至于無菌培養皿中，腹腔注入6～8 mL預冷的RPMI-1640培養基，用棉球輕揉腹部2～3 min后吸出腹腔液置于離心管中，重復洗2 次，收集以上培養基，1 400 r/min離心5 min，棄上清液收集巨噬細胞，用含體積分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養基重懸巨噬細胞并接種于培養瓶中，置于CO2培養箱（5% CO2、37 ℃）培養4 h后，輕輕吸棄培養液，用RPMI-1640培養基洗去未貼壁細胞，重復洗滌2 次，即得到純化的腹腔巨噬細胞。臺盼藍拒染法檢測其活性（＞95%），分別按每孔1×106個細胞接種于6 孔細胞培養板中。

1.3.2 流式細胞儀檢測巨噬細胞表面MR的表達

不同質量濃度PSG-1刺激6 孔板中細胞24 h后進行收集，移入標記好的 EP管中，1 400 r/min離心5 min，棄盡培養液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞2 次，加100 μL PBS重懸細胞；加入10 μL FITC標記的大鼠抗小鼠CD206抗體，同型對照管加入10 μL對照試劑FITC-IgG2a，4 ℃避光孵育30 min；孵育結束后，用PBS洗2 次，去除游離的抗體；重懸細胞成單個細胞懸液，將細胞液定量在1 mL左右，上流式細胞儀檢測，記錄各標本的陽性細胞百分率。

1.3.3 反轉錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）檢測巨噬細胞MR mRNA表達水平

細胞處理方法同1.3.2節，收集各組細胞以Trizol法提取總RNA，在20 μL反應體系中進行反轉錄為cDNA，每組取2 μL cDNA 用于PCR擴增，將得到PCR產物進行電泳，電泳后的凝膠通過凝膠成像儀觀察，并對條帶進行灰度分析，以β-actin為內參，測定其mRNA的相對表達量。

1.3.4 FITC-dextran測定巨噬細胞吞噬功能

用甘露聚糖2.5、5.0、10.0 mg/mL分別預處理巨噬細胞30 min，再予以160 μg/mL PSG-1刺激，另設空白對照組和160 μg/mL PSG-1組，刺激細胞24 h后棄去培養液并以PBS洗滌2 次，加100 μL PBS重懸細胞，加入FITC-dextran（5 mg/mL）2 μL，37 ℃繼續孵育1 h。用PBS終止反應，洗滌細胞2次，并重懸細胞。流式細胞儀分析細胞對FITC-dextran的吞噬作用。

1.3.5 ELISA法測定TNF-α、IL-1β的含量

細胞處理方法同1.3.4節，刺激結束后，收集巨噬細胞上清液，采用ELISA法測定TNF-α、IL-1β的含量，具體操作方法參照相應的試劑盒說明書進行。

1.3.6 RT-PCR檢測巨噬細胞TNF-α、IL-1β mRNA表達水平

細胞處理方法同1.3.4節，處理后的各組細胞進行RT-PCR，以β-actin為內參，測定TNF-α、IL-1β mRNA的相對表達量。實驗中用到的引物序列及退火溫度如表1所示。

表1 引物序列及退火溫度Table1 Primer sequences and annealing temperatures

1.4 數據分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件作圖，實驗數據以±s表示，采用統計軟件SPSS Statistics 19.0對實驗結果進行單因素方差分析，P＜0.05時，組間差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞表面MR表達的影響

圖1 PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞表面MR表達的影響Fig.1 Effect of PSG-1 on the expression of MR on the surface of mouse peritoneal macrophages

使用FITC-大鼠抗小鼠CD206抗體對巨噬細胞表面MR進行標記，流式細胞儀檢測陽性細胞率以反映PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞表面MR表達的影響。如圖1所示，正常巨噬細胞表面有MR的表達，加入PSG-1后，細胞表面MR表達呈劑量依賴性的增加，其中160 μg/mL PSG-1組比空白對照組上升了26.71%。

2.2 PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞MR mRNA表達水平的影響

如圖2所示，RT-PCR進一步檢測腹腔巨噬細胞MR mRNA表達水平，結果發現與流式細胞儀檢測的結果相似，加入PSG-1處理細胞后，MR mRNA表達量隨著PSG-1質量濃度的升高而上升。

圖2 PSG-1對小鼠腹腔巨噬細胞MR mRNA表達水平的影響Fig.2 Effect of PSG-1 on the mRNA expression level of MR in mouse peritoneal macrophages

2.3 MR抑制劑對PSG-1誘導小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

圖3 PSG-1通過MR影響小鼠腹腔巨噬細胞吞噬FITC-dextran的能力Fig.3 E ffect of PSG-1 on the phagocytosis of FITC-dextran by mouse peritoneal macrophages via MR

流式細胞儀檢測各處理組細胞吞噬FITC-dextran的能力，如圖3所示，與空白對照組相比，PSG-1能顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬FITC-dextran的能力；預先給予甘露聚糖2.5、5.0、10.0 mg/mL預處理細胞30 min后，再予以PSG-1作用，與PSG-1單獨刺激相比，細胞的吞噬能力顯著或極顯著下降，且10.0 mg/mL甘露聚糖處理組對PSG-1誘導的細胞吞噬能力抑制作用最強。

2.4 MR抑制劑對PSG-1誘導小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β的影響

由表2可知，正常腹腔巨噬細胞培養上清液中TNF-α和IL-1β的含量極低，PSG-1刺激后上清液中TNF-α和IL-1β的含量極顯著增加，遠高于空白對照組；提前30 min給予甘露聚糖2.5、5.0、10.0 mg/mL預處理細胞后再加入PSG-1，與PSG-1單獨刺激相比，IL-1β的含量顯著或極顯著降低，TNF-α的含量稍有降低，但與PSG-1單獨刺激相比無顯著差異。

表2 甘露聚糖對PSG-1誘導小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF--α、IL--1β的影響Table2 Effect of PSG-1 on the secretion of TNF- and IL-1 in mouse peritoneal macrophages via MR

2.5 MR抑制劑對PSG-1誘導小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-1β mRNA的表達水平的影響

圖4 甘露聚糖對PSG-1誘導小鼠腹腔巨噬細胞TNF--α、IL--1β mRNA表達水平的影響Fig.4 Effect of PSG-1 on the mRNA expression levels of TNF-α and IL-1β in mouse peritone al macrophages via MR

如圖4所示，空白對照組小鼠腹腔巨噬細胞TNF-α、IL-1β mRNA的水平較低，給予PSG-1刺激后，TNF-α、IL-1β mRNA的水平顯著增加；預先加入甘露聚糖2.5、5、10 mg/mL處理細胞，再加入PSG-1刺激，IL-1β mRNA的表達被抑制，且抑制作用與甘露聚糖的質量濃度呈劑量依賴性，TNF-α mRNA的表達略有降低，但與PSG-1單獨刺激相比無顯著性差異。

3 討 論

近年來的研究表明多糖的免疫調節作用主要是通過細胞表面相關受體介導的，這些受體稱為模式識別受體[8]（pattern recognition receptor，PRR）。PRR是多糖發揮免疫調節作用的樞紐，識別多糖后，與之結合引發一系列的信號級聯反應，從而誘導免疫基因的表達，激活免疫反應，發揮免疫調節作用[9]。因此對PRR的研究極大地促進了對多糖免疫調節作用機制的研究。目前發現的PRR主要包括Toll樣受體[10]（Toll-like receptors，TLRs）、樹突狀細胞相關C型凝集素-1[11]（dendritic cell-associated C-type lectin-1，Dectin-1）、MR[12]、補體受體3[13]（complement receptor，CR3）、清道夫受體[14]（scavenger receptor，SR）等。多糖與這些受體結合后可以激活細胞內的信號通路，進而活化免疫細胞，促進細胞因子的釋放調節免疫反應[8]。MR是PRR中的一種，可特異性地識別以甘露糖、巖藻糖或N-乙酰葡糖胺為末端的配體并與之結合，研究表明MR在病原體的識別、吞噬與清除[15]、感染[16]等許多過程中都發揮著重要的作用。

Yu Qiang等[17]研究表明PSG-1可能是通過活化NF-κB途徑激活巨噬細胞從而發揮免疫調節作用，隨后，Zhang Shenshen等[18]證明PSG-1能通過TLR4依賴的信號轉導通路提高機體免疫力，抑制腫瘤生長，其中TLR4是具有代表性的一種PRR。最新研究表明，PSG-1可以通過TLR4/ROS/PI3K/Akt/MAPKs/NF-κB信號通路發揮其對巨噬細胞的活化作用[19]。然而，PSG-1能否通過影響巨噬細胞MR的表達從而增強巨噬細胞的吞噬功能，以及通過MR誘導細胞因子TNF-α、IL-1β的分泌，目前尚未見報道，本實驗對此進行了研究。

在腹腔巨噬細胞表面有大量MR的表達，表明其在早期的免疫應答反應中發揮重要作用。MR已被證明參與病原體的吞噬作用，如甲型流感病毒[20]。蘆薈多糖[12]可經MR激活巨噬細胞，上調巨噬細胞表面MHC-Ⅱ（主要組織相容性抗原Ⅱ類分子）和FcγR （IgGFc段受體）的表達，MHC-Ⅱ可以提高巨噬細胞的抗原呈遞能力，FcγR則能增強巨噬細胞清除抗原抗體復合物或者抗體腫瘤細胞復合物的能力。Liu Li等[21]研究表明大黃多糖可明顯地升高結腸炎大鼠腹腔巨噬細胞MR的活性和吞噬能力。本實驗結果表明，經PSG-1處理后小鼠腹腔巨噬細胞表面MR的表達量呈劑量依賴性的升高， RT-PCR進一步測定結果表明PSG-1處理后MR mRNA表達水平隨著PSG-1質量濃度的增加而升高。由此推斷，PSG-1可以通過上調小鼠腹腔巨噬細胞MR mRNA表達水平從而促進細胞表面MR的表達。MR與多糖配體結合后，可增強巨噬細胞的吞噬活性，產生活性氧，激活轉錄因子NF-κB，并誘導細胞因子的分泌[22]。PSG-1可激活巨噬細胞的吞噬作用[17]，流式細胞儀檢測各處理組細胞吞噬FITC-dextran的能力，結果表明PSG-1促進的巨噬細胞吞噬功能被MR的競爭性抑制劑甘露聚糖劑量依賴性地減弱。由此可知，PSG-1可以通過上調MR的表達從而增強巨噬細胞的吞噬功能，抑制MR后，PSG-1對吞噬功能的促進作用減弱。殼寡糖可通過與巨噬細胞表面的MR結合，產生IL-1β和TNF-α[23]。郭振軍等[24]研究表明含有近50%甘露糖的大黃多糖和含有N-乙酰葡萄糖胺殘基的當歸多糖通過MR介導大鼠腹腔巨噬細胞TNF-α的分泌，而對IL-4的表達無影響。TNF-α主要由活化的單核-巨噬細胞產生，具有極為廣泛的生物學活性。例如調節巨噬細胞活性、免疫應答、調節造血、抗腫瘤、介導炎癥反應等。已有研究證明在RAW264.7巨噬細胞中，PSG-1能通過PI3K/Akt/MAPK/NF-κB信號轉導途徑誘導TNF-α的分泌[25]。本實驗檢測PSG-1單獨刺激的細胞與甘露聚糖預處理30 min后再加PSG-1刺激的細胞培養上清液中TNF-α的含量，結果顯示，甘露聚糖抑制MR后，對PSG-1誘導的TNF-α分泌無影響，且TNF-α mRNA的相對表達水平也無明顯差異，因此可以說明MR在PSG-1誘導的TNF-α分泌過程中無明顯作用。PSG-1誘導升高的另一細胞因子IL-1β的分泌量和mRNA表達水平則被甘露聚糖劑量依賴性地抑制，說明PSG-1對IL-1β的調節與MR有關。

綜上所述，相關研究表明組分中含有甘露糖的多糖可通過MR激活巨噬細胞從而調節免疫反應，考慮到PSG-1中含有部分甘露糖，本實驗通過體外培養小鼠腹腔巨噬細胞用于探討PSG-1對MR的影響，以及PSG-1是否能通過影響巨噬細胞MR的表達從而調節巨噬細胞的免疫功能，可為完善黑靈芝多糖免疫調節的分子機制提供理論依據。結果顯示，PSG-1可以上調巨噬細胞MR的表達，從而增強巨噬細胞的吞噬功能和相關細胞因子IL-1β的分泌，抑制劑抑制MR后，細胞吞噬功能減弱，IL-1β的分泌量減少。由此推測，PSG-1的免疫調節作用可能至少部分由MR介導。

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Effect of Polysaccharides from Ganoderma atrum on Mannose Receptor of Mouse Peritoneal Macrophages

SHUAI Xiao-xue, LI Wen-juan, LIU Dan-feng, WANG Yu-ting, ZHU Ke-xue, XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To explore the effect of polysaccharides from Ganoderma atrum (PSG-1) on the mannose receptor (MR) of mouse peritoneal macrophages. Methods: After the macrophages were treated with PSG-1 at various concentrations, the MR expression on the macrophage surface was analyzed by f ow cytometry, and then the mRNA expression level of MR was evaluated by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). After the cells were pretreated with mannan (an MR inhibitor) and then exposed to PSG-1, the phagocytosis of macrophages was assayed by f ow cytometric method, the contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) in cell culture supernatant were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the mRNA expression levels of TNF-α and IL-1β were determined by RT-PCR. Results: PSG-1 could increase the protein and mRNA expression levels of MR. Compared with the group treated with PSG-1 alone, the phagocytosis of macrophages and the secretion of IL-1β in cells pretreated with mannan were signif cantly inhibited and no effect on the secretion of TNF-α was observed in the presence of PSG-1. Conclusion: MR can partly mediate the immunoregulatory effect of PSG-1 on peritoneal macrophages in mice. Therefore, MR may be one of the receptors of PSG-1 associated with the immunomodulatory function.

polysaccharides from Ganoderma atrum; peritoneal macrophages; mannose receptor (MR); phagocytosis; cytokine

TS201.4

A

1002-6630（2014）23-0262-06

10.7506/spkx1002-6630-201423051

2014-06-27

國家自然科學基金重點項目（31130041）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31201326）

帥小雪（1989—），女，碩士研究生，研究方向為營養代謝與分子營養學。E-mail：shuaisnow@163.com

*通信作者：謝明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品營養學、食品安全、功能保健食品。E-mail：myxie@ncu.edu.cn