海參和海星皂苷對乳清酸誘導大鼠脂肪肝影響的比較研究

韓秀清，付雪媛，徐 杰，董 平，王靜鳳，薛長湖，王玉明

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

海參和海星皂苷對乳清酸誘導大鼠脂肪肝影響的比較研究

韓秀清，付雪媛，徐 杰，董 平，王靜鳳，薛長湖，王玉明*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

目的：研究并比較海參皂苷和海星皂苷對乳清酸誘導的長期大鼠非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的干預作用。方法：將雄性Wistar大鼠喂食1%乳清酸建立NAFLD模型，連續喂養6 周后，將大鼠分為乳清酸模型組（orotic acid group，OA）、海參皂苷組（sea cucumber saponins group，Scs）和海星皂苷組（starfish saponins group，Sfs），以未喂食OA的大鼠為正常對照組（control group，Con）繼續喂養8周后，分別測定大鼠肝臟甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、磷脂（phospholipid，PL）水平和血清TG、TC水平以及肝臟脂質合成、分解相關酶的酶活性和基因表達量。結果：海參皂苷和海星皂苷組肝脂及血脂水平均有明顯下降，此外，二者均能抑制脂肪酸合成酶活性，下調脂肪酸合成基因表達水平，增強脂肪酸β-氧化相關酶活性。結論：海參皂苷和海星皂苷均能明顯改善乳清酸長期誘導大鼠NAFLD，并具有類似的調控機制，其中海參皂苷和海星皂苷的改善效果相當。

非酒精性脂肪肝；海參皂苷；海星皂苷；乳清酸

近年來，非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）發病率明顯升高，并呈現低齡化趨勢[1-3]。目前，尋找能夠改善NAFLD的天然活性物質和食品功效成分是海洋食品研究的重要內容之一。前期研究發現，海洋棘皮動物海參由來的皂苷類化合物可有效抑制大鼠非酒精性脂肪肝的形成過程[4]。我國部分沿海具有食用海星習慣，海星同屬于海洋棘皮動物，是海洋動物皂苷的另一主要來源[5]。海參皂苷和海星皂苷雖同屬于海洋棘皮動物皂苷，但前者主要為三萜類皂苷，后者主要為甾體類皂苷，結構上的差異提示二者可能具有不同的生理活性[6-9]。本實驗采用乳清酸建立大鼠長期NAFLD模型，比較研究了海參皂苷和海星皂苷對長期NAFLD的治療和干預作用，并對其機制進行初步探討，為海星皂苷和海參皂苷的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級雄性Wistar大鼠，體質量（180±10）g，許可證號：SCXK（京）2007-0001，購自北京維通利華實驗動物公司。

1.2 材料與試劑

甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、葡萄糖測定試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測定試劑盒、谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）測定試劑盒、谷氨酰轉移酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；Trizol抽提試劑 美國Invitrogen公司；MMLV逆轉錄酶 美國Promega公司；HP型大孔樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司；AB-8型大孔樹脂 南開大學化工廠；其他試劑為國產分析純。

1.3 儀器與設備

Aglient1100型高效液相色譜儀 美國Aglient 公司；iQ5型Realtime PCR儀、Model680型酶標儀 美國Bio Rad公司；UV-2550型分光光度計 日本島津公司。

1.4 方法

1.4.1 海參皂苷和海星皂苷的制備

參照董平[10]的方法制備海參皂苷。革皮氏海參經干燥粉碎制成粉末，加60%乙醇熱回流抽提6次，合并各次抽提所得上清液，減壓回收乙醇，得水溶液，過HP-20型大孔樹脂，依次用水和80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液減壓濃縮，經真空冷凍干燥后得海參皂苷。

參照張錚[11]的方法制備海星皂苷。新鮮海星8 kg，加95%乙醇12 L浸提過夜得上清液，再加入60%乙醇溶液反復浸提2 次，合并各次抽提所得上清液，減壓回收乙醇，得水溶液，過AB-8型大孔樹脂，依次用水和80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液減壓濃縮，經真空冷凍干燥后得海星皂苷。

1.4.2 動物分組與喂養

動物先適應性喂養1 周，之后將Wistar大鼠按體質量分為2 組：正常對照組（Con，n=8）和乳清酸組（n=24），分別喂食標準飼料和1%乳清酸飼料6 周后，將乳清酸組隨機分為模型組（OA組，n=8）、海參皂苷組（Scs，n=8）及海星皂苷組（Sfs，n=8），分別喂食1%乳清酸飼料、分別含0.04%海參皂苷和0.04%海星皂苷的1%乳清酸飼料，飼養8 周。基于AIN93M基礎飼料配方配制各組飼料，飼料配方見表1。大鼠自由攝食飼料和飲水，在室溫（23±2）℃，明暗交替各12 h條件下喂養。飼料每日更新并測定攝食量，并記錄每周體質量變化。喂食14 周后于前夜禁食不禁水5 h后，乙醚麻醉下腹主動脈取全血處死，取肝臟、腎周脂肪、附睪脂肪等臟器組織稱質量后，液氮速凍后于－80 ℃保存，備用。

表1 各組飼料配方Table 1ble 1 Compositions of experimental diet

1.4.3 肝臟脂質含量、血清指標測定

參照Folch等[12]的方法，準確稱取0.25 g肝臟，制成肝臟脂質抽提液，參照試劑盒說明書分別測定肝臟TC、TG含量。血液室溫靜置30 min后，7 500 r/min離心獲得血清，參照試劑盒說明書測定血清TG、TC、葡萄糖、AST、ALT、GGT水平等血清理化指標。

1.4.4 肝臟脂肪代謝相關酶活性測定

用含有0.25 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA和10 mmol/L Tris的緩沖液（pH 7.4）于4 ℃制備肝勻漿，以750×g離心10 min，去除沉淀。上清液先以12 000×g離心20 min，收集沉淀，按文獻[13-14]方法用于肉堿棕櫚酰轉移酶-1（carnitin palmitoyl transferase-1，CPT-1）、過氧化物酶體β-氧化酶系活性測定。二次離心所得上清液再以125 000×g離心60 min，收集上清液用于測定脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、蘋果酸酶（malic enzyme，ME）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）活性，方法參照文獻[15-16]。

1.4.5 基因mRNA表達檢測

采用Trizol提取肝臟總RNA，逆轉錄按照試劑盒說明書進行，實時熒光PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環。各基因的mRNA表達量均以18sRNA量比值表示，并將對照組定為100%。實驗中所用到的引物序列如表2所示。

表2 實驗中所需引物序列Table2 Primers used in this study

1.5 數據分析

2 結果與分析

2.1 大鼠體質量、攝食量及臟器質量變化

圖 1長期攝食海參皂苷和海星皂苷對NAFLD大鼠體質量影響（n＝8）Fig.1 Effects of sea saponins and starfish saponins on body weight in rats (n=8)

表3 長期攝食海參皂苷和海星皂苷對大鼠生長指標和各組織器官影響（n＝8）Table3 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on growth parameters and organs in rats (n=8)

由圖1可知，各組大鼠體質量均無明顯差異，實驗測定了腎周脂肪和附睪脂肪等內臟脂肪組織含量，各組比較均無明顯差異，但由于乳清酸誘導脂肪肝模型中，機體脂肪代謝紊亂，大量脂肪沉積在肝臟，即異位脂肪沉積作用[17]，模型組的內臟脂肪含量為各組中最低。與對照組相比，模型組大鼠肝臟質量顯著增加了63.0%（P＜0.001），海參皂苷和海星皂苷對大鼠肝臟質量無明顯影響（表3）。

2.2 大鼠肝臟脂質含量變化

圖2 長期攝食海參皂苷和海星皂苷對NAFLD大鼠肝脂質水平影響（n＝8）Fig.2 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on hepatic lipids in rats (n = 8)

如圖2所示，喂食乳清酸14 周后，模型組大鼠肝臟TG、TC水平分別是對照組的12.4、2.82倍（P＜0.05），海參皂苷和海星皂苷干預后，與模型組相比，大鼠肝臟TG含量分別下降了38.3%和41.2%，肝臟TC含量分別下降了32.4%和18.4%。

2.3 血清中脂質和肝功能酶學指標變化

圖3 長期攝食海參皂苷和海星皂苷對NAFLD大鼠血清指標影響（n＝8）Fig.3 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on serum indexes in rats (n = 8)

2.4 肝臟脂肪酸合成酶活性變化

圖4 長期攝食海參皂苷和海星皂苷對肝臟脂肪酸合成相關酶活性的影響（n＝8）8Fig.4 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on the hepatic enzyme activities involved in fatty acid biosynthesis in rats (n = 8)

如圖3所示，與正常組相比，模型組血清TG水平下降了20.6%。與模型組相比，海參皂苷組和海星皂苷組血清TG水平分別降低了61.8%（P＜0.05）和51.4%（P＜0.05），血清TC水平無顯著性差異。血清中AST、ALT、GGT活性測定結果顯示，模型組大鼠血清AST、ALT、GGT活性分別是對照組的5.2、2.9和1.2 倍（P＜0.05）。海參皂苷和海星皂苷不同程度地下調了血清GGT活性，此外，海星皂苷明顯下調了血清ALT活性（P＜0.05），而海參皂苷對血清ALT和AST活性無明顯調控作用。

如圖4所示，長期喂食乳清酸后，大鼠肝臟ME酶活性顯著上升，而G6PDH酶活性卻有所下降。海參皂苷和海星皂苷干預后，大鼠肝臟ME酶活性分別下降了17.5%和40.5%（P＜0.05）；但是，海參皂苷對G6PDH酶活性無顯著影響，海星皂苷卻顯著上調了G6PDH酶活性。FAS是內源性長鏈脂肪酸合成過程中的最后一步的限速酶，長期喂食乳清酸后大鼠肝臟FAS酶活性顯著下降（P＜0.05），兩皂苷干預后雖無顯著性變化，但表現出下降趨勢。

2.5 肝臟脂肪酸β-氧化酶活性變化

圖5 長期攝食海參皂苷和海星皂苷對肝臟脂肪酸β-氧化相關酶活性的影響（n＝8）Fig.5 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on the hepatic enzyme activities involved in fatty acid -oxidation in rats (n = 8)

如圖5所示，脂肪肝模型組大鼠肝臟CPT-1酶活性和過氧化物酶體β-氧化酶系活力均顯著下降，說明模型組肝臟的脂肪β-氧化能力受到明顯抑制。海參皂苷和海星皂苷干預后，大鼠肝臟CPT-1和過氧化物酶體β-氧化酶系能力均顯著上升，表明海參皂苷和海星皂苷能顯著促進肝臟脂肪酸的分解利用。

2.6 肝臟脂肪酸合成相關基因mRNA表達量的變化

固醇調節元件結合蛋白1（sterol regulatory element binding proteins1，SREBP1）可調控脂肪合成代謝酶，如FAS的基因表達[18-19]。如圖6所示，海參皂苷組和海星皂苷組大鼠肝臟SREBP1-c、FAS和ME的mRNA表達水平均有顯著下調（P＜0.05），其中海參皂苷組的FAS和ME基因表達下調尤為明顯，分別下調了66.4%和38.5%，而海星皂苷組的SREBP1-c和G6PDH基因下調尤為明顯，分別下調了33.6%和36.7%（P＜0.05），表明海參皂苷和海星皂苷可能通過下調相關基因的表達抑制肝臟的脂肪合成，且綜合看來，二者的調節水平相當。

圖6 長期攝食海參皂苷和海星皂苷對大鼠肝臟脂質合成相關基因表達的影響（n＝8）8Fig.6 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on the mRNA expression levels related to fatty acid biosynthesis in rats (n = 8)

2.7 肝臟脂肪酸分解相關基因mRNA表達量的變化

圖7 長期攝食海參皂苷和海星皂苷對大鼠肝臟脂肪酸β-氧化相關基因表達的影響（n＝8）Fig.7 Chronic effects of sea saponins and starfish saponins on the mRNA expression levels related to fatty acid β-oxidation in rats (n = 8)

過氧化物酶體增殖物激活受體-α（peroxisome proliferators activated receptor-α，PPAR-α）參與脂肪酸β-氧化相關基因的轉錄調控，本實驗檢測了肝臟PPAR-α及其靶基因的mRNA表達量變化。結果表明，乳清酸飲食引起肝臟PPAR-α基因及其靶基因CPT-1和ACO不同程度上的表達下調，但各皂苷組和乳清酸模型組相比，3 種基因的表達水平都無明顯變化。

3 討 論

已有報道表明海參皂苷對NAFLD的形成和發展階段具有預防作用。Hu Xiaoqian等[20]通過大鼠短期喂養模型，研究發現海參皂苷對乳清酸誘導的NAFLD有較好的預防作用，但其主要探討海參皂苷對NAFLD形成期間機體脂肪代謝的影響。本實驗通過長期喂食乳清酸建立大鼠NAFLD模型后再給予海參皂苷和海星皂苷的干預，探究其對乳清酸誘導NAFLD的影響。實驗結果發現：海參皂苷明顯降低了肝臟以及血清TG的含量，對乳清酸誘導大鼠NAFLD有較好的干預和改善效果。

已有研究表明，乳清酸誘導脂肪肝模型中肝臟TG的蓄積以及血清TG含量的降低與其分泌脂蛋白能力降低有關[21]。為了明確海參皂苷降低肝臟脂質水平的機制，本實驗測定了肝臟脂肪酸代謝相關酶活性和基因水平。臟脂質代謝過程中，ME 和G6PDH為脂肪酸合成提供NADPH。FAS可催化乙酰-CoA和丙二酰-CoA合成脂肪酸，是肝臟脂肪酸合成的關鍵限速酶[22-23]。動物體內進行脂肪酸β-氧化代謝的場所主要包括線粒體、過氧化物酶體，其中CPT是線粒體脂肪酸β-氧化的限速酶。實驗結果表明，海參皂苷在不同程度上抑制了脂肪合成相關酶FAS和ME的酶活性，并明顯提升了肝臟脂肪酸氧化相關酶CPT的酶活性和過氧化物酶體β-氧化能力，這與Hu Xiaoqian等[20]的研究結果一致。但是，與已有研究不同的是，本實驗長期喂食海參皂苷后大鼠肝臟G6PDH的酶活性并未降低，這可能與乳清酸喂養的時間較長有關。此外，海參皂苷下調了肝臟脂肪合成相關基因SREBP1-c、FAS、ME的mRNA表達水平，但對脂肪酸β-氧化相關基因的表達水平并無明顯影響。也有研究表明，海參皂苷可以通過抑制消化道內胰脂肪酶的活性，抑制和減緩的脂質吸收，從而起到降低肝臟脂質的作用[24]。因此，海參皂苷對肝臟脂質過度蓄積的改善作用較為復雜，是多因素共同作用的結果。

海星中含有的海星皂苷與海參皂苷結構顯著不同，研究結果證實，海星皂苷具有抗腫瘤、抗真菌、抗病毒、抗炎癥、抗潰瘍、麻醉和降血壓等多種藥理活性[25]。到目前為止，國內外有關海星皂苷對脂質代謝影響的報道較少，更未見海星皂苷對NAFLD影響的相關研究。本實驗探究了海星皂苷對乳清酸長期誘導NAFLD的改善作用，并將其與同屬于海洋皂苷的海參皂苷進行比較。結果發現，海星皂苷同樣通過抑制肝臟脂肪合成氧化相關基因表達和酶活性改善乳清酸長期誘導的NAFLD。

綜上所述，海參皂苷和海星皂苷均能在乳清酸誘導NAFLD形成以后，通過調節脂肪酸合成和β-氧化分解相關酶活性以及相關基因表達量改善機體的脂肪代謝異常現象，且海參皂苷和海星皂苷的改善效果相當。

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Effects of Sea Cucumber Saponins versus Starfish Saponins on Orotic Acid-Induced Fatty Liver in Rats

HAN Xiu-qing, FU Xue-yuan, XU Jie, DONG Ping, WANG Jing-feng, XUE Chang-hu, WANG Yu-ming*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: In this research, the effects of sea cucumber saponins and starfish saponins on nonalcoholic fatty liver induced by orotic acid (OA) in rats were comparatively investigated. Methods: Modified AIN-93G diet containing 1% orotic acid (OA diet) was used to establish NAFLD rat model. After 6-week feeding of OA diet, 24 male Wistar rats were randomly divided into three groups (eight rats in each group) and then fed with the corresponding diets for 8 weeks: OA group; OA diet; Scs group: OA diet containing 0.04% sea cucumber saponins; Sfs group: OA diet containing 0.04% starfish saponins. The rats fed the modified AIN-93M diet were used as a control group (Con). After 14 weeks of feeding, body weights, liver weights, visceral adipose weights, serum triglyceride (TG), serum total cholesterol (TC), liver functional indexes, hepatic TG, hepatic TC and hepatic phospholipids (PL) were measured. The enzyme activities and gene expressions involved in hepatic lipid metabolism were also determined. Results: Compared with the OA group, sea cucumber saponins and starfish saponins significantly reduced hepatic TG and TC levels (P ＜ 0.05). These two saponins alleviated the fatty liver through inhibiting the enzymes activities and gene expressions involved in hepatic lipogenesis and enhancing the activities of peroxisomal β-oxidation enzymes in liver. Conclusion: In summary, sea cucumber saponins and starfish saponins could efficiently alleviate NAFLD induced by orotic acid in rats with similar regulatory mechanisms. Meanwhile, sea cucumber saponins revealed similar lipid-lowering effects as sea starfish saponins.

nonalcoholic fatty liver disease; sea cucumber saponins; starfish saponins; orotic acid

TS218

A

1002-6630（2014）23-0268-06

10.7506/spkx1002-6630-201423052

2014-06-15

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B07）；教育部“新世紀優秀人才支持計劃”項目；教育部留學回國人員科研啟動基金項目

韓秀清（1988—），女，碩士研究生，研究方向為水產化學與分子營養學。E-mail：hxiuqing@126.com

*通信作者：王玉明（1973—），男，教授，博士，研究方向為食品營養學。E-mail：wangyuming@ouc.edu.cn