體外模擬3 種消化液對鐵皮石斛多糖的消化作用

張冠亞，黃曉君，聶少平,*，崔武衛,2

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.加拿大農業與農業食品部圭爾夫食品研究中心，安大略 渥太華 N1G 5C9）

體外模擬3 種消化液對鐵皮石斛多糖的消化作用

張冠亞1，黃曉君1，聶少平1,*，崔武衛1,2

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.加拿大農業與農業食品部圭爾夫食品研究中心，安大略 渥太華 N1G 5C9）

本實驗采用人體胃腸道模擬系統，體外模擬3 種消化液對鐵皮石斛多糖的消化行為。通過高效凝膠液相色譜、鐵氰化鉀法和高效離子交換色譜分別測定消化后多糖分子質量變化、還原糖含量和單糖組成的情況。結果表明：唾液不能改變鐵皮石斛多糖的分子質量；模擬胃液和模擬胃腸液可以降低多糖的分子質量，同時提高多糖溶液中的還原糖含量，但沒有檢測到單糖。結論：在體外模擬胃腸道的消化體系中，鐵皮石斛多糖的分子質量減小，糖苷鍵發生斷裂，但沒有游離單糖的釋放。

鐵皮石斛多糖；體外消化；分子質量；還原糖；單糖

do i:10.7506/spkx1002-6630-201423054

植物多糖是構成生命活動的四大基本物質之一，與維持生命功能有密切關系，具有免 疫調節、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、抗凝血等功效。Franz[1]曾報道指出，已發現有近百種植物的多糖沒有細胞毒性且應用于生物體毒副作用小。鐵皮石斛（Dendrobium off c inale Kimura et Migo）是一種名貴的中藥材，主要生長在我國西南和江南各省，自古以來就有“藥中黃金”之美譽，民間稱其為“救命仙草”[2-3]。體內和體外實驗研究表明，鐵皮石斛多糖作為一種植物性多糖具有顯著的體外抗氧化[4]、增強免疫[5-6]、抗腫瘤[7]、降血糖[8-9]的作用，其應用具有廣闊的前景。

消化是一項復雜的體內代謝活動，由于消化系統的復雜性、實驗模型難以建立、體內大分子難以控制等因素影響，消化實驗難以在活體中進行。體外模擬消化既能在一定程度上真實模仿人體內環境，同時節省了大量資源，方便且易于控制[10]。人體消化系統由消化腺和消化管兩部分組成。消化腺包括口腔唾液腺、肝、胰及消化管壁內的小腺體；消化管自上而下包括口 腔、咽、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回 腸 ）和大腸（盲腸、結腸和直腸）[11]。消化作為人代謝和營養物質吸收的關鍵步驟，是實現將食物大分子物質轉化為能被機體吸收的小分子物質，進而被腸道吸收進入機體并通過特定相關代謝部位發揮功能的過程。多糖作為大分子糖類，一般認為是難以在胃腸道被人體消化吸收的[12]，因此該特性被利用來制作藥物的保護涂層[13]。多糖的主要代謝途徑是在結腸處被腸道微生物酵解，產生大量的短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸[14]。但是，一些對 多糖的體外模擬消化實驗表明，多糖在人體消化液中是發生著結構和分子質量的變化的[15]。 鐵皮石斛多糖作為一種具備多種生理活性的植物多糖，研究它在人體內的代謝特點是一項極具前景和應用性的工作。目前，還沒有關于 鐵皮石斛多糖在人體上消化道（即食管、胃、 小腸）消化情況的報道。因此本實 驗以 人體胃腸道模擬系統為基礎，并在實驗設計上加以改進[16]，希望探索出鐵皮石斛多糖在體內的消化情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛多糖，由云南金九地生物科技有限責任公司提供鐵皮石斛干品制得[17]。

單糖標品：鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸 上海國藥試劑公司；體外消化酶：胃脂肪酶（56.7 U/mg）、胃蛋白酶（800～2 500 U/mg）、胰酶、胰蛋白酶、膽鹽 美國Sigma公司；氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、乙醇、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

ICS 5000 離子色譜儀（配有金電極和 ICS 5000 色譜工作站） 美國戴安公司；LC 1260高效凝膠液相色譜系統（配有示差檢測器和 LC1260 色譜工作站） 美國安捷倫公司；MD 200-1氮氣吹掃儀 杭州奧盛儀器有限公司；SHZ-III 型循環真空泵、DE-52AA 旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；T6紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；FE 20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RC806溶出儀 天津天大天發公司。

1.3 方法

1.3.1 體外消化液配制

唾液消化液和體外模擬胃液的配制參考文獻[15]。腸電解質溶液：5.4 g NaCl、0.65 g KCl、0.33 g CaCl2溶于 1 L的去離子水。7 g/100 mL胰酶溶液：7 g 胰酶溶于100 mL水，3 000 r/min離心10 min，取上清液待用。4%膽鹽溶液：4 g膽鹽溶于196 mL水，3 500 r/min離心10 min，取上清液待用。體外模擬腸液[18]：100 mL胰酶溶液中加入100 mL 腸電解質溶液、200 mL膽鹽溶液和13 mg胰蛋白酶，混合均勻，用 1 mol/L NaHCO3調節pH值至7。

1.3.2 胃電解質、沸水浴、失活消化酶對鐵皮石斛多糖分子質量的影響

在2 mg/mL多糖溶液中分別加入等體積的水和胃電解質溶液，37 ℃恒溫于溶出儀作用6 h后取樣。將1 mg/mL鐵皮石斛多糖溶液置于沸水浴中加熱，在15 min時取樣。將胃、腸消化液置于沸水浴中加熱，分別在5、10、15 min時停止水浴，再與2 mg/mL多糖溶液等體積混合，37 ℃恒溫下于溶出儀反應6 h后取樣。

以上樣液分別過0.22 μm水相膜，經高效凝膠液相色譜測多糖保留時間。色譜條件為：色譜柱為Waters UltrahydrogelTM50 0（7.8 mm×300 mm，10 μm），流動相為NaN3，流速為0.6 mL/min，檢測器為RID，柱溫箱和檢測器的溫度均為35 ℃，進樣量為20 μL[19]。

1.3.3 體外模擬消化

1.3.3.1 唾液對鐵皮石斛多糖的消化作用

2 mg/mL多糖溶液與等體積唾液充分混合后，在37 ℃恒溫下反應2、4、6 h后終止反應，將多糖溶液換成去離子水作為空白組，重復上述操作。

1.3.3.2 模擬人體胃液對鐵皮石斛多糖的消化作用

將150 mL質量濃度為2 mg/mL多糖溶液與150 mL模擬胃液混合置于溶出儀的溶出杯，密閉。37 ℃恒溫、轉速為150 r/min、擺動幅度為0.5 mm條件下分別反應2、4、6 h后，通過真空泵移出10 mL反應液，迅速置于沸水浴中5 min終止反應。

1.3.3.3 模擬人體胃腸液對鐵皮石斛多糖的消化作用

在1.3.3.2節剩余反應液 （6 h）中加入模擬腸液，使反應液與腸液體積比為10∶3，保持溶出儀工作狀態繼續反應，在2、4、6 h時終止反應并收集消化液。

1.3.4 模擬消化產物的分子質量測定

取1.3.3.1、1.3.3.3節反應后的樣液，4 800 r/min離心10 min，取離心上清液，過0.22 μm水相膜，通過高效凝膠液相色譜LC1260測定其分子質量的變化。色譜條件同1.3.2節。

1.3.5 模擬消化產物的還原糖含量測定

取1.3.3.1、1.3.3.3節的上清液，利用鐵氰化鉀法測溶液中還原糖含量[20]。測試之前，先用1 mol/L NaHCO3將溶液pH值調至7。取1.5 mL上清液，加入2 mL鐵氰化鉀試劑，待充分混勻后，沸水水浴加熱15 min，然后冷卻至室溫，于420 nm波長處測定吸光度。

1.3.6 模擬消化產物的單糖含量測定

將1.3.5節的剩余上清液全部裝入500～1 000 D透析袋后，將透析袋置于含有50 mL生理鹽水的自封袋中，透析時間與模擬消化時間一致。取透析袋外的液體，過0.22 μm水相膜，通過離子色譜檢測單糖組成。以生理鹽水作為空白對照。

單糖混標溶液配制：稱取5 mg單糖標品（L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-核糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖醛酸和D-半乳糖醛酸）溶于1 L去離子水，即為5 μg/mL混標母液。再將母液稀釋成0.5、1、2、4、5 μg/mL梯度，在離子色譜ICS 5000中進樣。離子色譜條件：CarboPac PA20分析柱（3 mm×150 m m，6.5 μm）和CarboPac PA 20G保護柱（3 mm×30 mm，6.5 μm），流速為0.5 mL/min，進樣量25 μL，檢測器為金電極，柱溫箱溫度為30 ℃，檢測器溫度為35 ℃[21]。

1.4 數據分析

以上實驗均平行3 次，得到的數據經過SPSS 13.0軟件處理，用Turkey檢驗分析顯著性。

2 結果與分析

2.1 電解質溶液對鐵皮石斛多糖的作用

高效凝膠液相色譜是一種排阻色譜，根據溶質分子尺寸（分子質量、有效體積、流體力 學體積）的差別 進而進行分離和檢測。是用來表征高聚物的重要方法[22]。通過多糖的保留時間來測量多糖的分子質量已經成為研究多糖一種基本方法[23]。在同一色譜條件下，保留時間越長，分子質量越小；反之，分子質量越大。

圖1 胃電解質對多糖分子質量的影響Fig.1 Effect of gastric electrolyte on the molecular weight of the polysaccharide

本實驗通過分 析多糖分子質量變化來直觀研究多糖的消化情況，因此排除溶液中其他因素對多糖排阻圖譜的表征極為重要。消化液所處的溶液是電解質緩沖液，含有自由移動的離子。它們與多糖在空間上分子的排布可能會相互影響，進而影響多糖的分子質量表征[21]。由胃電解質色譜圖（圖1）可知，電 解質在15 min之前無峰出現，15.5、17.5 min 有兩個峰出現。而多糖的峰出現在12.5 min，且在17 min有一個溶劑倒峰。多糖的電解質溶液12.5 min的峰與多糖峰幾乎重合，經計算，該峰的出峰時間與多糖水溶液出峰時間無顯著差別，其后在15.5、17.5 min出現的峰比電解質的峰低，這是與多糖的溶劑倒峰疊加所形成。圖1表明電解質作為一種緩沖溶液，不會對鐵皮石斛多糖的圖譜表征產生任何影響。

2.2 沸水浴對多 糖分子質量和消化酶活性的影響

圖2 高溫和失活的酶對多糖分子質量的影響Fig.2 Effects of boiling water bath heating and inactivation of digestive enzymes on the molecular weight of the polysaccharide

在實驗中為了控制消化時間，必須對反應2、4、6 h后的多糖溶液進行沸水浴終止。由圖2a可知，多糖溶液加熱前后出峰時間是一致的，經過計算，加熱前后多糖的洗脫時間均無顯著差異（P＞0.05），說明沸水加熱對多糖的分子質量沒有影響。

將胃腸消化液分別沸水加熱5、10、15 min后再與多糖混合，結果見圖2b、2c。反應后的溶液依舊有信號很強的電解質的色譜峰，同時多糖位置的峰也幾乎重合。將出峰時間做顯著性分析得知，沸水浴后的消化酶不能改變多糖的分子質量，而該結果與2.3節實驗結果對比可發現消化酶已經失去了活性。因此，可以將消化反應的終止條件設定為：沸水水浴5 min。

2.3 模擬消化后分子質量和還原糖含量變化

唾液是與食物接觸的第一個消化液，而胃腸道消化是將胃和小腸看成一個消化體系，多糖在胃液中作用了6 h，再進入模擬腸環境繼續發生反應。

表1 消化后分子質量和還原糖含量的變化Table1 Changes in molecular weight and reducing sugar content after digestion

經測定，本實驗所用的鐵皮石斛多糖分子質量為（314.51±6.09）kD。由表1可知，從唾液的消化結果來看，多糖的保留時間無顯著變化，即分子質量無顯著性差異，還原糖含量也沒有顯著變化，說明唾液不能消化鐵皮石斛多糖，這與Hu Jielun等[15]在車前子多糖體外模擬口腔消化中的結果是一致的。多糖在模擬胃液中，保留時間隨時間延長而增加，分子質量逐漸減小，在模擬胃液中反應6 h后分子質量為（244.79±2.99）kD，而還原糖含量也隨時間延長而增加，從側面說明了多糖分子支鏈產生了變化，糖苷鍵發生了斷裂。多糖在腸道的消化中，分子質量進一步減小，反應2 h后，多糖分子質量減小到（229.91±1.59）kD，與4、6 h的分子質量無顯著性差異，還原糖含量也表現出同樣的趨勢，說明消化反應已經到達了終點。

2.4 模擬消化后的單糖產生情況

圖3 多糖消化后的離子色譜圖Fig.3 Ion exchange chromatogram of the polysaccharide after digestion

由2.3節結果可知，多糖發生了糖苷鍵的斷裂，可能生成了寡糖或者單糖[24]，使得還原糖的含量增加，暴露出更多的還原末端。將反應后的消化液裝入500～1 000 D的透析袋，那么只有小分子寡糖或者單糖可以自由進出透析袋。ICS 5000離子色譜系統具有高靈敏度、高效率、低消耗的特點，在單糖組分測定中有許多優勢[25]。由圖3可知，胃腸道消化液中均沒有檢測到單糖，表明消化后沒有游離單糖的釋放。多糖作為大分子物質，其空間結構復雜，主鏈和支鏈都是由糖苷鍵連接而成，糖苷鍵的斷裂會使多糖的分子質量減小，多糖的性質也可能隨之發生改變[26]。

3 結 論

本實驗通過體外模擬人體消化系統，分別模擬了唾液、胃液和胃腸液對多糖的消化作用。在體外模擬實驗中，多糖經過加熱處理或者與電解質緩沖液作用均不能對多糖的分子質量產生影響，這為后續實驗排除了干擾。實驗用的消化酶具有較高的活性，為了控制反應，必須第一時間使酶失活終止反應。消化酶分別經過5、10、15 min的水浴，再與多糖溶液混合，結果顯示水浴5 min便可以使酶失去活性。失去活性的酶與多糖混合，不能對多糖的圖譜表征產生影響。在此基礎上，進一步研究了解3 種消化液在體外模擬消化體系中對多糖的消化作用。唾液不能改變多糖的分子質量，在模擬胃和模擬腸道中，多糖的分子質量降低，同時還原糖含量增加。經過透析的消化液并沒有檢測到單糖的產生，說明消化過程中并沒有產生單糖。綜上所述，鐵皮石斛多糖在模擬胃腸道消化體系中分子質量降低，糖苷鍵發生了斷裂，但是沒有釋放出游離的單糖。

參考文獻：

[1] FRANZ G. Polysaccharides in pharmacology. Current application and future concepts[J]. Planata Medicine, 1998, 55(6): 493-497.

[2] 付偉麗, 黃作喜, 唐正義, 等. 鐵皮石斛多糖研究進展[J]. 內江師范學院學報, 2011, 26(4): 40-44.

[3] 盛家榮, 李志華, 易艷波, 等. 鐵皮石斛多糖的研究進展[J]. 廣西科學院學報, 2011, 27(4): 338-338.

[4] 鮑素華, 查學強, 郝杰, 等. 不同分子量鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性研究[J]. 食品科學, 2009, 30(21): 123-127.

[5] 蔡海蘭, 黃曉君, 聶少平, 等. 鐵皮石斛多糖對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響[J]. 中國藥理學通報, 2012, 28(11): 1553-1556.

[6] XIA Linjing, LIU Xiaofei, GUO Huiyuan, et al. Partial characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides from the stem of Dendrobium off cinale (Tiepishihu) in vitro[J]. Journal of Functional Foods, 2012, 4(1): 294-301.

[7] 張紅玉, 戴關海, 馬翠, 等. 鐵皮石斛多糖對S180肉瘤小鼠免疫功能的影響[J]. 浙江中醫雜志, 2009, 44(5): 380-381.

[8] 李秀芳. 霍山石斛和四種藥典石斛多糖降血糖活性比較研究[D]. 合肥: 合肥工業大學, 2012: 17-18.

[9] XING Xiaohui, CUI S W, NIE Shaoping, et al. A review of isolation process, structural characteristics, and bioactivities of water-soluble polysaccharides from Dendrobium plants[J]. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre, 2013, 1(2): 131-147.

[10] GUERRA A, ETIENCE-MESMIN L, LIVRELLI V, et al. Relevance and challenges in modeling human gastric and small intestinal digestion[J]. Trends in Biotechnology, 2012, 30(11): 591-600.

[11] 石戈, 王健鑫, 劉雪珠, 等. 褐菖魚由消化道的組織學和組織化學[J].水產學報, 2007, 31(3): 293-302.

[12] XU Xiaofei, XU Pingping, TANG Jian, et al. Gut microbiota, host health, and polysaccharides[J]. Biotechnology Advances, 2013, 31(2): 318-337.

[13] MARONI A, DEL C MD, ZAMA L, et al. Film coatings for oral colon delivery[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2013, 457(2): 372-394.

[14] ZHOU Mengyi, PU Chuanliang, XIA Lin, et al. Salecan diet increases short chain fatty acids and enriches beneficial microbiota in the mouse cecum[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 102: 772-779.

[15] HU Jielun, NIE Shaoping, MIN Fangfang, et al. Artificial simulated saliva, gastric and intestinal digestion of polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 92(2): 1143-1150.

[16] CHEN Jianshe, GAIKWAD V, HOLMES M, et al. Development of a simple model device for in vitro gastric digestion investigation[J]. Food & Function, 2011, 2(3/4): 174-182.

[17] 黃曉君, 聶少平, 王玉婷, 等. 鐵皮石斛多糖提取工藝優化及其成分分析[J]. 食品科學, 2013, 34(22): 21-26.

[18] BLANQUET S, ZEIJDNER E, BEYSSAC E, et al. A dynamic artificial gastrointestinal system for studying the behavior of orally administered drug dosage forms under various physiological conditions[J]. Pharmaceutical Research, 2004, 21(4): 585-591.

[19] 林慧霞, 聶少平, 殷軍藝, 等. 大粒車前子多糖提取工藝優化及其理化性質測定[J]. 食品科學, 2010, 31(22): 226-231.

[20] 張永勤, 王哲平, 宋雨梅, 等. 還原糖測定方法的比較研究[J]. 食品工業科技, 2010, 31(6): 321-323.

[21] 閔芳芳, 聶少平, 萬宇俊, 等. 青錢柳多糖在體外消化模型中的消化與吸收[J]. 食品科學, 2013, 34(21): 24-29.

[22] 鐘亞蘭, 蔣序林. 高效液相色譜表征高聚物[J]. 化學進展, 2010, 22(4): 706-712.

[23] 謝建華, 謝明勇, 聶少平, 等. 青錢柳中多糖含量的測定[J]. 分析試驗室, 2007, 26(8): 33-36.

[24] 鄒曉莉, 江水, 鄭波, 等. 高效陰離子色譜法分離測定蜂蜜和保健食品多糖水解產物中的單糖組成[J]. 四川大學學報: 醫學版, 2008, 39(5): 836-838.

[25] 李靜, 李仁勇, 梁立娜. 毛細管型離子色譜-脈沖安培法檢測枸杞多糖的單糖組成[J]. 分析化學, 2012, 40(9): 1415-1420.

[26] SINGH V, KUMAR P, SANGHI R. Use of microwave irradiation in the grafting modi cation of the polysaccharides-a review[J]. Polymer Science, 2012, 37(2): 340-364.

Effects of Three Digestive Juices on the in vitro Digestion of Dendrobium off cinale Polysaccharide

ZHANG Guan-ya1, HUANG Xiao-jun1, NIE Shao-ping1,*, CUI Wu-wei1,2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Guelph Food Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, Ottawa N1G 5C9, Canada)

The effects of th ree digestive juices on the in vitro digestion of Dendrobium officinale polysaccharide were investigated by using human gastrointestinal model system in vitro. By using high performance liquid chromatography (HPLC), potassium ferricyanide and high performance iron exchange chromatography (HPIEC), we determined the changes in the molecular weight, reducing sugar content and monosaccharide composition of the polysaccharide after digestion. Results showed that the digestion in saliva did not change the molecular weight of Dendrobium off cinale polysaccharide. The digestion in simulated gastric juice and gastrointestinal juice reduced the molecular weight, and increased the reducing sugar content, but no monosaccharides were detected in the digested solution. Conclusion: After digestion in simulated gastrointestinal system, the molecular weight of Dendrobium off cinale polysaccharide was reduced and the glycosidic bond was broken, but without releasing free monosaccharide.

Dendrobium off cinale polysaccharide; in vitro digestion; molecular weight; reducing sugar; monosaccharides

TS201.2

A

1002-6630（2014）23-0279-05

2014-06-26

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B06）；國家國際科技合作專項（2013DFA32710）；教育部“新世紀優秀人才支持計劃”項目（NCET-12-0749）；江西省對外科技合作計劃重點項目（20141BDH80009）；江西省高等學校科技落地計劃項目（KJLD13004）

張冠亞（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品科學與工程、食品質量與安全。E-mail：1195194129@qq.com

*通信作者：聶少平（1978—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與分析、食品營養與安全、糖化學與糖生物學。E-mail：spnie@ncu.edu.cn