幾種肝郁動物造模方法比較及鼠籠加報紙固定束縛法的效果觀察?

黃 聰，倪祥惠，曹 峰，趙 博，張小容，葉金竹，吳大梅，吳 菁

(貴陽中醫學院, 貴陽 550002)

早期中醫界并沒有肝郁證動物模型，由于肝郁證常常表現出精神抑郁、煩躁易怒等情志改變，類似現代醫學的抑郁癥，故中醫學界常常借用現代醫學之抑郁癥動物模型研究肝郁證。

結合現代醫學的抑郁癥動物模型，中醫學界又創造出具有中醫特色的肝郁證動物模型的制作方法，研究這些方法大概可分為兩大類：一是應用藥物造成急、慢性中毒損傷等復制模型，如艾葉注射法[1]、CCl4注射法[2]、腎上腺素注射法[3]等；二是情志刺激造模法，如頸部帶枷單籠喂養法[4]、夾尾激怒打斗法[5]、束縛法(改良)[6]、捆綁法[7]、慢性輕度不可預見性應激(CUMS)造模法[8]以及居住者-入侵者(resident-intruder paradigm)造模法[9]。根據課題的需要，我們選擇了情志刺激造模方法，在實驗過程中比較了頸部帶枷單籠喂養法、夾尾激怒打斗法、束縛法(改良)、捆綁法、慢性輕度不可預見性應激(CUMS)造模法以及居住者-入侵者造模法，發現這些造模方法存在各自的優缺點，現將使用體會報告如下。

1 常見非藥物造模法使用體會

1.1 頸部帶枷單籠喂養法

頸部帶枷單籠喂養法是一個較經典的方法，在實驗過程中較難以控制的是模具頸部孔洞的大小，孔洞稍大大鼠即可在前肢協助下脫離模具，而孔洞稍小即會因動物頻繁抵抗試圖脫離枷具而出現頭頸部皮膚損傷。

1.2 夾尾激怒打斗法

作為經典造模方法的夾尾激怒打斗法，在實驗過程中，夾尾大鼠常會出現攻擊其余大鼠的現象，容易操作，易達到實驗目的，但是在實驗中常出現大鼠軀體損傷現象。

1.3 束縛法(改良)

束縛法以及改良束縛法的操作方法較多，有專門的束縛籠、T型束縛架、鋼制束縛筒等，其操作簡單，易達到實驗目的。使用中發現，專門的束縛籠、鋼制束縛筒經常因不能很好地適應大鼠體型，造模過程中大鼠有著較大的活動空間。

1.4 捆綁法

捆綁法可以視為一種較特殊的束縛法，就是使用繃帶束縛大鼠肢體限制活動的造模方法，是一種使動物產生“郁怒”從而導致“肝郁證”動物模型的特殊方法。這種方法看似簡單，但是在具體操作過程中發現該方法實現常有如下困難：①用繃帶固定，大鼠大多會將繃帶咬斷；②用繃帶捆綁大鼠肢體，如果太緊就會出現大鼠肢端血液回流障礙，出現肢端水腫，過度緊時間長還會出現肢端壞死；如果稍松則很難將大鼠固定住，大鼠很容易掙脫，前肢尤其容易掙脫。

1.5 慢性輕度不可預見性應激造模法(CUMS模型)

慢性輕度不可預見性應激造模法是目前現代醫學常用的制作抑郁癥的經典方法，一般3周即可完成造模，是由CMS模型(chronic mild stress)減輕刺激強度、延長持續時間演變而來。操作過程中，操作相對容易，但是操作流程相對復雜，且存在刺激強度不好把握的情況，如無規則搖晃、如何把握其強度等問題。但是總體而言，該造模法是信度、效度較好的方法。

1.6 居住者-入侵者造模法

居住者-入侵者造模法是近年出現的抑郁證造模方法，也是利用動物之間爭斗導致動物情志異常的造模方法，該方法相對容易操作，但常有不同種或者不同窩雄性動物之間相安無事的情況出現，導致動物造模失敗。

2 自創鼠籠加報紙固定束縛法

在實驗過程中，我們利用大鼠鉆洞的習性，自創鼠籠加報紙固定束縛法束縛大鼠，使用普通大鼠鼠籠操作，簡單方便，其具體方法如下：利用大鼠鉆洞的習性，使大鼠鉆入鼠籠，如大鼠不鉆可輕拉鼠尾，大鼠即會自動鉆入位于頭前部的鼠籠，然后用報紙填塞大鼠后面的鼠籠空間(也可使用其他紙張，一般報紙既柔軟又有一定強度)，注意報紙要往鼠籠邊的方向上塞緊，以防松動。放置大鼠時，要讓大鼠四肢在上，束縛期間可以通過觀察大鼠能否自行翻轉判斷束縛是否松動。

依據湖南陳澤奇等[10]將30名肝氣郁結病人(應用湖南醫科大學中西醫結合研究所經鑒定的標準診斷)，以精神情志變化為特征分為偏煩躁型、偏抑郁型和中間型(即抑郁、煩躁并見或交替出現者)，測定病人血漿中去甲腎上腺素(NE)和腎上腺素(E)的含量，發現平均NE、 E含量與健康人相近，相同分型不同病種間NE、E含量相近，但是偏煩躁型病人的NE、E含量顯著高于偏抑郁型和中間型病人，偏抑郁型病人的NE、E含量顯著低于中間型病人及健康人對照組。這一點與抑郁癥和躁狂癥中樞神經遞質的變化相仿佛(有研究表明，在抑郁或躁狂時中樞5-HT含量均低下，在抑郁時中樞NE缺乏或相對缺乏，躁狂時中樞NE過多)。借鑒目前抑郁大鼠常用的檢測神經遞質以判斷抑郁模型成功與否的方法，課題組對比觀察了使用鼠籠加報紙固定束縛法與慢性輕度不可預見性應激造模法造模情況，比較了2種造模方法造模第1、2、3周模型大鼠體質量變化值以及第21天大腦海馬、額葉中神經遞質5-HT、DA、NE含量的變化，發現兩者之間在體質量上差異有統計學意義，而神經遞質比較差異無統計學意義。

2.1 材料與方法

2.1.1 實驗動物及分組 健康SPF級雄性SD大鼠40只，體質量150～200 g，來自第三軍醫大學醫學實驗動物中心(許可證號SCXK(渝)2012-0005)，隨機分為2組并編號各20只，每5只1籠。

2.1.2 試劑 大鼠腦遞質多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自上海雅吉公司，系分裝美國R&D 公司產品。

2.1.3 造模方法 2組動物分為束縛組和慢性輕度不可預見性應激(CUMS模型)造模組。動物適應性喂養1周后，束縛組每天使用鼠籠加報紙固定束縛法束縛2 h。慢性輕度不可預見性應激(CUMS模型)造模組每天隨機使用束縛2 h、無規則搖晃45 min、45℃熱刺激5 min、4℃冷水游泳5 min、晝夜顛倒24 h、禁食24 h、禁水加空瓶刺激12 h、濕籠24 h這8種刺激中1～2種。造模過程中有3只動物死亡。

2.1.4 動物及標本處理 觀察動物反應，第21天處理動物。所有動物均按30 mg/kg體質量用3%戊巴比妥鈉麻醉后斷頭，冰上取海馬以及額葉組織，-70℃冰箱保存備用。

標本稱重后，按1∶10(w∶v)加入0℃磷酸緩沖液(PBS)，使用勻漿器勻漿后，12000 r/min4℃離心15～20 min后取上清，分別按照試劑盒要求檢測大鼠額葉、海馬多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)含量。

2.2 結果

表1顯示，所有動物均于造模前、第1、2 周及處死前稱重，每組體質量變化值以及神經遞質含量均符合正態分布。2組動物中，單純束縛組體質量均較CUMS模型組增多，且同一時間段體質量變化值比較除第2周沒有差異外，其余時間段比較差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 模型動物不同時間段體質量變化值比較

注：與相應束縛組比較：**P<0.01

表2顯示，盡管2組動物在同一時間段體質量變化差異有統計學意義，但是在第21天時大腦額

葉、海馬中神經遞質的含量沒有差異。

表2 模型動物第21天時海馬、額葉DA、NE、5-HT值比較

2.3 討論

慢性輕度不可預見性應激造模法(CUMS模型)是信度、效度較好的經典抑郁癥造模方法，中醫學也常借用來制作肝郁(脾虛)證動物模型。通過以上研究表明，應用慢性輕度不可預見性應激造模法制作的肝郁證模型動物存在著體質量顯著減輕的情況，這表明動物在造模期間機體消耗較多或合并有合成代謝較差。

體質量的減輕并不作為肝郁證的臨床表現特征。國內外的一些流行病學調查及臨床報道也表明，許多慢性疲勞患者在發病前曾有過長期精神緊張、不愉快的生活事件及生活習慣的改變等(也即與心理、社會等應激因素有關)，發病后常伴有精神抑郁或急躁易怒、健忘等精神神經癥狀、認知行為的改變及免疫功能紊亂等，臨床中肝郁證病人可以出現體質量減輕的情況，但其減輕是肝郁的必然結果還是或然癥？肝郁證與體質量減輕之間有否因果關系？如有什么樣的因果關系還有待探討。

綜上所述，作為制造肝郁證動物模型的慢性輕度不可預見性應激造模法，是否能夠準確地反映肝郁證值得進一步商榷。本課題組采用的鼠籠加報紙固定束縛法對體質量的影響遠較慢性輕度不可預見性應激造模法要輕，大腦內神經遞質的含量變化在造模第3周時沒有差異，且不需要特殊設備，操作簡便易行，可以作為一種備選的肝郁證造模方法。

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