HPLC法測定四季柚的黃烷酮類化合物

吳 丹, 劉 英, 陳健初

(1. 浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院, 浙江 杭州 310058；2. 杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測中心, 浙江 杭州 311100)

0 引 言

柚子(Citrusgrandis(L. ) Osbeck) 是蕓香科柑桔屬植物，盛產(chǎn)于我國東南及南方，種植面積和產(chǎn)量均居世界首位。四季柚為柚子的優(yōu)良品系之一，具有滋陰、清熱、開胃、消食、解酒、降壓降脂、清肺等功效[1-3]。柚果實(shí)中不僅含有多種人體必需營養(yǎng)元素，還含有一些非營養(yǎng)性生理活性成分，如黃烷酮糖苷類化合物，包括柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等，這些成分具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗微生物、抑酶、降血糖、降血壓、預(yù)防動脈粥樣硬化等活性[4-8]。

本文建立了一種高效液相色譜法(HPLC)，該方法可同時測定四季柚果汁中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3種黃烷酮糖苷類化合物含量。3種黃烷酮糖苷類化合物的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

一般黃烷酮檢測方法包括光譜法[9-10]、色譜法[11-13]、毛細(xì)管電泳法[14]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]等，以HPLC最為常用，通常通過梯度洗脫方式獲得理想的圖譜數(shù)據(jù)。本文通過等梯度洗脫HPLC法同時測定3種黃烷酮糖苷類化合物，簡便快捷、靈敏度高、重新性好，為四季柚的黃酮類物質(zhì)檢測提供技術(shù)參考。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Waters2696-2996，PDA測器)；SOCOREX系列移液槍；Mettler Toledo GB204 萬分之一分析天平(上海天平儀器廠)；DKS-24型 電熱恒溫水浴鍋(杭州藍(lán)天化驗儀器廠)；DFT-200手提式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司)；YP1200電子天平(上海第二天平儀器廠)；離心機(jī)(Eppedorf)；SHZⅢ型循環(huán)水多用真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

標(biāo)準(zhǔn)品：橙皮苷(純度≥98%)，柚皮苷(純度95%)，新橙皮苷(純度90%)，購于Sigma公司。

試劑：乙酸(AR)，甲醇(HPLC級和AR)，乙醇(AR)購于杭州雙林化工試劑廠，娃哈哈純凈水購于超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取柚皮苷9.0 mg ，新橙皮苷7.8 mg, 橙皮苷4.4 mg，用色譜級甲醇溶解，并完全轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中用甲醇定容制成混標(biāo)工作液。

1.3 色譜條件

色譜柱：安捷倫C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) ；流動相：水∶甲醇∶乙酸=56∶40∶4；檢測波長283 nm；流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4 樣品處理

四季柚樣品取之浙江蒼南縣，一份為未成熟樣品，9月底份采摘；另一份為成熟樣品11月底采摘。采下后將果皮和果肉剝離，果肉部分置于四層紗布中手工擠汁得到四季柚果汁，果汁取15 mL于50 mL三角瓶中，加入15 mL甲醇超聲20 min，將汁液轉(zhuǎn)入離心管，4 000轉(zhuǎn)離心10 min, 取上清液備用。

1.5 高效液相色譜測定

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液和處理好的樣品溶液按照色譜條件進(jìn)樣并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

取混標(biāo)工作液稀釋到適當(dāng)濃度進(jìn)行HPLC分析。研究表明,當(dāng)流速為1.0 mL/min時，3種黃烷酮標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果最好，在10 min內(nèi)得到良好的分離圖譜，3種黃烷酮化合物的保留時間分別為：柚皮苷7.92 min，橙皮苷8.71 min，新橙皮苷9.59 min(見圖2)。

圖2 混標(biāo)HPLC譜圖(依次為柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷)

2.2 線性范圍和檢出限

分別取混標(biāo)工作液0，2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0 mL于6只10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，得到系列濃度，每一濃度分別平行測定3次，以平均峰面積y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)作圖，擬合線性回歸方程,見表1。柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷的線性回歸方程R2>0.999 3，顯示了較好的線性關(guān)系。

表1 3種黃烷酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍及回歸方程

2.3 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性

取混合對照工作液稀釋5倍，連續(xù)測定6次，計算得到3種黃烷酮的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不高于2.5%，表明儀器精密度良好。取5倍稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)液，在室溫下放置1、2、3、4、5 h后進(jìn)樣分析，得到3種黃烷酮物質(zhì)的峰面積的RSD均不高于4.5%，表明該方法穩(wěn)定性良好，待測溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。取5倍稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)液6份，在上述色譜條件下測定，結(jié)果柚皮苷，橙皮苷，新橙皮苷的平均含量分別為35.20，30.16，18.00 μg/mL，RSD分別為2.22%，3.33%，2.27%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取已知含量的樣品6份，分別按照相當(dāng)于樣品中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量的80%，100%，120%的量加入各對照品，制備待測樣品溶液，按色譜條件測定，計算得加樣回收率為95%～103%。

2.5 樣品測定

取處理后的成熟和未成熟的四季柚果汁樣品各3份，按照色譜條件進(jìn)行測定，根據(jù)回歸方程計算含量，結(jié)果見表2。可以看到，四季柚果汁中3種黃烷酮類化合物的含量隨成熟度有所不同，未成熟的四季柚果汁中以柚皮苷含量最高，其次為橙皮苷，新橙皮苷含量最低；而成熟果汁中以橙皮苷含量最高，柚皮苷含量有明顯下降，而新橙皮苷沒有檢出。

表2 未成熟與成熟時期四季柚果汁中主要黃烷酮成分的含量

3 結(jié) 語

本文建立了同時測定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量的HPLC法。經(jīng)驗證，該方法簡便，表現(xiàn)出良好的線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度。可用于四季柚及其他柚子果汁或者果皮中的相關(guān)黃烷酮類物質(zhì)含量的測定。

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