核磁共振法無損傷測定五峰綠茶中咖啡因含量

陳連清， 陳 玉， 周忠強， 曾 雄

(中南民族大學 化學與材料科學學院， 湖北 武漢 430074)

0 引 言

茶葉中含有多種生物堿，其主要成分為咖啡因，咖啡因含量是衡量茶葉品質的重要指標之一[1]。少量咖啡因能使身心處于一種興奮狀態，刺激機體的中樞神經系統，誘發腎上腺素釋放入血，增高機體血糖水平，提高注意力。過量的咖啡因使人精神疲倦、身體發顫、難以入睡、刺激胃粘膜。目前測定茶葉中咖啡因含量的方法有碘滴定法、紫外分光光度法、薄層色譜法和高效液相色譜法等。碘量法中，Na2S2O3標準溶液穩定性較差，容易受水中的CO2、微生物等作用而被氧化，滴定要求高、操作復雜，極易造成誤差，測定準確性低[2]；紫外分光光度法前處理過程復雜，由于是利用咖啡因結構上的嘌呤環有共軛雙鍵體系，具有獨特吸收波長274 nm來測定，其測量值是茶葉中嘌呤堿的總量，測定結果往往偏高[3]；薄層色譜法的展開劑選擇過程繁瑣煩，分離效果直接影響測定結果的準確性，實驗誤差較大[4]；高效液相色譜法是目前測定咖啡因含量的國際通用方法，但由于儀器昂貴，普通實驗室條件無法滿足，在測定前，樣品需要用幾種有機溶劑反復萃取、回收溶劑，操作繁瑣，樣品微量成分會損失，測定結果偏低[5-9]。上述方法共同的缺點是必須損壞樣品才能進行測定。如何無損傷且快速準確地測定各種茶葉中的咖啡因含量并嘗試建立一種衡量茶葉品質的指標是擺在科學家面前的一大難題。

核磁共振法(NMR)是一種現代儀器分析方法。NMR 技術最初只應用于物理學領域，隨著超導技術、計算機技術和脈沖傅里葉變換波譜儀的迅速發展，NMR已成為當今鑒定化合物結構和研究化學動力學等極為重要的方法，其在有機化學、食品科學領域中的應用也越來越廣泛，特別是無損傷測定樣品中某一成分含量技術越來越受到人們青睞[10-13]。NMR能檢測的化合物并不要求有揮發性或生色團，其測定樣品是非破壞性的，這意味著樣品在測定后還可以用于其他方法分析。更重要的是，只要很少的樣品預處理，就可以獲得提取物的結構信息。

本文采用微型實驗裝置對茶葉中咖啡因的提取方法進行了探討，并通過NMR建立咖啡因含量和核磁氫譜積分面積標準曲線方程，從而通過標準曲線求解五峰綠茶咖啡因含量。該方法操作簡便、試劑用量少、無損傷，重現性好、專屬性強、準確可靠。

1 儀器與試劑

傅里葉紅外光譜儀(KBr壓片, Nexus 470 FTIR型，日本島津)、核磁共振儀(Bruker AVANCE 400 MHz型，德國)、微型電熱套、XT-4顯微熔點測定儀、Mettler Toledo AG204電子天平、UV-9100型紫外可見分光光度計、DL-101-2B烘箱(天津中環實驗電爐公司)、KQ-250DB型超聲波清洗器、LGJ-10冷凍干燥機(北京松源華興科技發展公司)，TDZ4-WS臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器公司)，真空干燥箱。蒸餾水、甲醇、DMSO-d6(99.9 %, TMS, Cambridge Isotope公司)，95 %乙醇，生石灰等均為市售分析純，使用前沒有進一步純化。五峰綠茶由湖北五峰翠碧春茶葉專業合作社提供。

2 方法與結果

2.1 咖啡因提取

茶葉中提取咖啡因是有機化學實驗教學中天然產物提取的經典實驗，該實驗一般采用常量法，以乙醇為溶劑，采用Soxhlet提取器連續提取，對提取液脫色，蒸發溶劑得到咖啡因粗品，用生石灰除去水分及丹寧酸等雜質，再通過升華提純獲得純品。實驗溶劑用量較大，耗時較長，學生不易操作Soxhlet提取器，尤其是對升華操作中溫度的控制難以掌握。針對上述難題，本文提出針對性改進意見：采用微型實驗裝置；用恒壓滴液漏斗代替索氏提取器；改進升華裝置；用過量氧化鈣中和殘夜里酸性物質，使實驗裝置更簡便，易操作，實現了平衡狀態下的連續萃取，縮短了實驗時間，提高了咖啡因的產率和純度[14]。

圖1 提取裝置圖2 電熱套升華裝置

具體操作：在25 mL圓底燒瓶中加2粒沸石，稱取1.0 g茶葉，研細拌勻，用濾紙包好放入恒壓漏斗中，按圖1所示搭好提取裝置。加入15 mL乙醇，回流，乙醇蒸汽從恒壓漏斗側管上升，冷凝后滴到茶葉上，當溶劑能浸泡茶葉時，調節恒壓漏斗活塞，使冷凝液滴入速度與放液速度一致，熱溶劑重復使用，茶葉每一次都接觸到新溶劑，提取0.5 h。改為常壓蒸餾裝置，濃縮提取液至2.0 mL。將殘液轉移到蒸發皿中，不斷攪拌下，加入1.5 g 氧化鈣，邊蒸邊碾，至固體變為細小粉末，再利用電熱套的余熱焙炒片刻，除盡水分。冷卻后，將塞有棉花的三角漏斗倒扣上面，放在電熱套上加熱升華 (見圖2)，當濾紙上出現少許毛狀結晶時，暫停加熱，冷卻，收集白色針狀晶體，產量為13.4 mg。

2.2 咖啡因標樣的制備

咖啡因晶體55℃真空干燥2 h，于蒸發皿中再次升華得到咖啡因標樣，測其熔點，溴化鉀壓片測定紅外光譜,如圖3所示。標樣用XT-4顯微熔點儀測定熔點為234.34～235.67 ℃，與國家藥典報道值一致[15]，紅外光譜經數據庫檢索后與咖啡因圖譜一致。

2.3 NMS測定咖啡因含量

2.3.1樣品前處理

經過2次升華后得到的咖啡因晶體作為標樣。待測五峰綠茶充分研磨過60目篩，55℃真空干燥2 h。準確稱取(0.500±0.001) g待測干燥茶葉粉末置于50 mL錐形瓶，加入10 mL 70%的甲醇水溶液，稱重后超聲提取30 min，冷卻后補重，以3 000 r/min離心10 min，準確量取0.48 mL上清液，在真空干燥器中揮發干甲醇后，加入適量蒸餾水，混勻后冷凍干燥。冷凍干燥后獲取的提取粉末，置于干燥器中，作為待測樣品避光保存。

2.3.2核磁測試條件[16]

將標樣或充分干燥的五峰綠茶提取物用0.48 mL DMSO-d6( 99.9%+0.03%V/V TMS) 溶解后，轉移入核磁樣品管進行NMR測定。NMR測試條件: DMSO-d6作為內鎖，299.5 K，掃描128次，產生37 268個數據點，譜寬為8 223.685 Hz，采樣時間2.0 s，脈沖間隔1.00 s，使用預飽和壓制序列在δ3.315處壓制水峰。通過核磁自帶軟件Topspin 進行傅里葉變換，將TMS峰定位為D0.00，手動調節相位，通過MestRe-C軟件調基線后，以0.01為最小間隔積分，計算峰面積(見圖4)。

圖4 咖啡因標樣的核磁氫譜標準圖

2.3.3標準曲線的繪制

準確稱取0.003、0.006、0.009、0.012、0.015、(0.018±0.001) g咖啡因標樣，用0.48 mL DMSO-d6溶解后，轉移入樣品管進行測定。通過核磁共振法得到6個不同濃度的咖啡因氫譜圖，利用δ8.05(s, 1H)處質子峰積分面積建立咖啡因含量與氫譜積分面積標準曲線：以核磁氫譜積分面積(y)為縱坐標，咖啡因標樣含量(x)為橫坐標，建立咖啡因標準曲線(見圖5)，得到標準曲線方程為:y=100.428 57x+0.125 39，相關系數R=0.999 9。表明咖啡因在0.125 4～2.234 3 mg時，核磁氫譜積分面積與咖啡因含量呈現良好的線性關系。

圖5 咖啡因含量與核磁氫譜積分值標準曲線

2.3.4精密度

稱取0.012 g標準樣品，用0.48 mLDMSO-d6溶解后，轉移入樣品管重復測試6次。結果表明，δ8.05(s, 1H)處質子峰積分面積的相對標準偏差 (RSD)為0.9 %，小于2 %，說明核磁共振儀的精密度良好。

2.3.5穩定性

稱取0.012 g標準樣品，用0.48 mLDMSO-d6溶解后，分別于樣品制備好后0、2、4、6及8 h進行測試，測定質子峰積分面積。結果表明，咖啡因積分面積的RSD為1.56%，說明標樣溶液在8 h內穩定性良好。

2.3.6重現性

對同一批標準樣品用0.48 mL DMSO-d6溶解后，轉移入樣品管測定質子峰積分面積并計算咖啡因含量，其RSD為1.23%。表明同批樣品經多次測定，重現性良好。

2.3.7回收率

取經過測定，咖啡因含量為0.252 4 mg五峰綠茶待測DMSO-d6溶液6份，各0.48 mL，分別加入咖啡因標準樣品約0.2 mg，測定其核磁氫譜，結果見表1。平均回收率為99.8 %，說明加標回收率良好。

表1 加標回收率測定(n = 6)

2.4 五峰綠茶樣品測定

將充分干燥的綠茶提取物用0.48 mL DMSO-d6溶解后，轉移入樣品管進行NMR測定。同一樣品平行測試3次。通過MestRe-C軟件調基線后，對待測樣品δ 8.05(s, 1H)質子峰進行積分，利用標準曲線來求取對應樣品中咖啡因含量(見圖6)，結果見表2。研究表明，不同等級的五峰綠茶咖啡因含量差異較大，特級茶中咖啡因含量在10 %以上，一、二、三級五峰綠茶中咖啡因含量在6%～8%之間，而炒青茶屬于采收末期的茶葉，咖啡因含量小于5%。可見咖啡因含量是五峰綠茶等級的一個客觀評判指標。

圖6 某待測五峰綠茶的核磁氫譜圖

茶葉等級咖啡因含量/%相對標準偏差/%特級12．560．49一級10．150．36二級8．730．62三級7．350．59炒青5．120．48

3 結 語

與傳統實驗方法相比較，采用微型實驗裝置，符合綠色化學要求，減少溶劑用量；利用恒壓分液漏斗替代Soxhlet提取器，儀器不易損壞，實現平衡狀態下連續提取，大大縮短時間；增加氧化鈣用量，可完全中和丹寧酸，減少色素和雜質，產率提高；利用電熱套升華裝置，通過鐵圈調節蒸發皿的高度，調節電熱套電壓的大小來控制加熱溫度，使升華溫度精確控制，避免樣品碳化和變焦，為得到高純度、高產率的咖啡因提供了重要的保證[17]。

本文首次利用核磁共振法譜圖積分功能，建立咖啡因含量與特定氫原子積分面積的標準曲線，利用甲醇提取冷凍干燥技術制樣，測定不同等級的五峰綠茶咖啡因的含量，創造性建立了快速準確、無損傷，預處理簡便的茶葉中咖啡因含量測定方法。該方法并不要求樣品有揮發性或生色團，樣品是非破壞性的，樣品在測定后還可以用于其他方法分析，其靈敏度也非常高，操作簡單、快速準確，測定結果可作為評價不同等級五峰綠茶質量的重要評判指標。本文建立的“核磁共振法無損害茶葉中咖啡因含量”的檢測方法還可以應用到其他食品的檢測，如測定地溝油、摻假成品油中油料含量，測定摻水牛奶中的造假程度(水的含量)等。

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