熒光法測定藥品中維生素B2含量的綜合型實驗設計

程春英， 尹學博

(南開大學 化學學院 化學實驗教學中心和分析科學研究中心，天津 300071)

0 引 言

培養學生的創新能力、科學研究能力、發現問題和解決問題的能力，是高等教育的重要目標，研究性、綜合型實驗的開發和設計也因此成為高校教育研究的主題之一，并成為素質教育和創新能力培養的重要載體[1]。通過研究性、綜合型實驗不但讓學生熟練掌握教學中的知識點，同時可以激發學生的科研創新的理念、提高學生發現問題、解決問題的能力[2-3]。

儀器分析實驗的教學目是熟練使用儀器、了解儀器的構造、掌握儀器的性能和使用方法。學生按照規定的程序操作并完成實驗報告的做法已不能滿足激發學生求知欲的要求[4]。學生只是對已知實驗過程的簡單重復和已知實驗結論的簡單驗證降低了實驗教學的效果[5-6]。機械單調的重復不能加深學生對儀器的原理、操作的掌握和創新思維的培養。

通過加入驗證內容，讓學生提出問題，并找到問題的答案成為研究性、綜合型實驗的設計理念。即實驗的內容需要體現學生對現有知識的思考、疑惑和求證；實現對現有知識的拓展應用，并培養學生的科學思維和創新能力[1]。

基于上述思想，我們對傳統實驗進行改革，發展研究性、綜合型實驗，本文討論了熒光法測定維生素B2研究性、綜合型實驗的設計和探索，通過條件控制實驗和藥片中維生素B2熒光分析方法的建立培養學生科學研究的能力和創新思維[7]。

1 實驗部分

(1) 儀器。日本島津RF-5301PC型熒光分光光度計；上海雷磁pHSJ-3F型pH計；安捷倫CARY-60型紫外-可見分光光度計；分析天平。

(2) 藥品。分析純維生素B2；醋酸；0.5 mol/L氫氧化鈉溶液；商品化維生素B2片劑。

(3) 溶液的配制。① 儲備液的配制。準確稱取10.0 mg維生素B2，溶于適量的1%的醋酸溶液中，轉入1 000 mL容量瓶中，用1%的醋酸溶液定容至刻度，然后保存在棕色試劑瓶中，并置于陰暗處[8]。② 系列標準溶液的配制。取5個25 mL的比色管，避光條件下，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的儲備標準溶液，用0.5%的醋酸稀釋至刻度，搖勻[8]。③ 樣品的處理。避光條件下，稱取維生素B2片劑一片的質量為0.078 1 g。為獲得藥品中維生素B2的平均含量，將5片維生素B2研磨，再從研細的粉末中稱取一片的質量0.078 1 g。將其溶解在50 mL 1%的醋酸溶液，超聲5 min使其溶解[9]，取出5 mL溶液用1%的醋酸溶液定容在1 000 mL的容量瓶中，置于陰暗處待測。

2 結果與討論

2.1 學生課前預習，了解維生素B2的結構和性質

維生素B2又叫核黃素(riboflavin)，分子式為C17H20O6N4，結構簡式如圖1所示[10]。是一種含核糖醇基的桔黃色的針狀晶體[11]，微溶于水、乙醇、氯仿等，易溶于醋酸，可溶于稀的氫氧化鈉和氯化鈉溶液[12]。

圖1 維生素B2的結構簡式

酸性條件下的溶液中維生素B2較穩定，耐熱、耐氧化，光照易分解，堿性條件下，維生素B2分解的更快。維生素B2在機體內與ATP作用，可生成在代謝上有極其重要功用的幾種酶的輔酶[11]。

2.2 測試條件的選擇

2.2.1最大激發波長和最大發射波長的選擇

取醋酸酸化的維生素B2溶液(CB2=0.4 μg/mL)作熒光激發光譜圖和熒光發射光譜圖，求得維生素B2的最大激發和最大發射波長：λex=468.8 nm，λem=524.0 nm。

2.2.2熒光強度隨pH的變化

取CB2=10 μg/mL的溶液，選擇λex=468.8 nm，λem=524.0 nm，測定不同pH下B2溶液的熒光強度，其變化趨勢如圖2所示。酸性條件下，維生素B2有較強的熒光強度，從pH 2.56開始熒光緩慢增強，并在pH 6.50熒光強度達到最大；隨后，熒光強度迅速降低，在pH 11時熒光幾乎消失[8]。因此，從熒光效率角度考慮，維生素B2應選擇在近中性條件下進行測定。

圖2 不同pH的維生素B2溶液的熒光強度變化曲線

2.2.3維生素B2穩定性考察

熒光強度的變化提供了維生素B2穩定性的直接證據。取維生素B2溶液(CB2=0.4 μg/mL)，選擇λex=468.8 nm，λem=524.0 nm，考察不同pH 4.5和6.5條件下熒光強度隨光照時間t的變化。變化曲線如圖3所示，可以看出隨光照時間增加，維生素B2的熒光強度逐漸降低，但pH 6.5時，變化幅度更大。證明了維生素B2的光學不穩定性，而且酸性越弱，越容易發生光分解反應。所以，維生素B2的標準溶液和樣品應避光保存。

2.3 分解機理初探

2.3.1光照前后維生素B2吸收光譜的變化

為給學生以直觀的印象，我們進一步考察光照過程，維生素B2紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的變化，并提出維生素B2光分解的初步機理。取pH=2.56，C=10 μg/mL B2溶液，作不同光照時間的吸光光譜圖(見圖4)。B2在280、375和444 nm處有最大吸收[12-14]。但隨著光照時間的增加，各處的吸收峰逐漸降低，并在光照1 h后444 nm處吸收峰幾乎消失，同時在400 nm出現一個新的吸收峰。圖4結果表明維生素B2在光照作用下生成了新的物質并導致最大吸收波長的移動。

圖3 維生素B2的不同光照時間的熒光強度變化曲線

圖4 pH 2.56,C=10 μg/mL的維生素B2溶液不同光照時間的吸光度光譜圖

2.3.2不同日照時間維生素B2的熒光光譜圖

取的維生素B2溶液(pH 4.5，C=0.6 μg/mL)，選擇λex=468.8 nm，作不同光照時間的熒光光譜圖。如圖5所示，隨著光照時間的增長，熒光強度逐漸變小，但最大發射波長沒有變化。結合紫外可見吸收光譜結果，我們可以得出維生素B2光分解的初步結論：在酸性條件，1%的醋酸溶液中，維生素B2發生光分解，并形成沒有熒光的產物。

圖5 pH 4.5，C=0.6 μg/mL的維生素B2溶液在不同光照時間的熒光光譜圖

2.4 藥片中維生素B2的測定

2.4.1干擾實驗

根據藥片成分可知維生素B2藥片含有維生素B2和輔料淀粉；實驗中選擇的熒光測定基質是1 %醋酸溶液。建立維生素B2的熒光測定方法前，需要考察輔料淀粉和醋酸溶液對維生素B2測定的潛在干擾。如表1所示，淀粉懸濁液和飽和溶液在不同pH條件下均具有可以忽略的熒光，證明輔料淀粉不會干擾藥片中維生素B2的測定。同樣醋酸在λex=468.8 nm，λem=524.0nm的測定條件下，熒光強度僅為0.371。說明醋酸基質不會干擾維生素B2的熒光測定。

表1 淀粉懸濁液和飽和淀粉溶液的比較

2.4.2藥品中維生素B2測定條件選擇

根據上面分析，雖然pH 6.5時，維生素B2的熒光強度最大，但此條件下維生素B2的分解速度較快，可導致較大的測定誤差。但從圖2可以看出，pH 4.5時，維生素B2的熒光強度雖較pH 6.5時略有降低，但圖3的結果表明pH 4.5時，維生素B2的穩定性更高，所以我們選擇酸性較強的醋酸溶液(pH 4.5)進行維生素B2標準液和樣品的溶解并用于樣品分析。為進一步避免維生素B2的分解，標準液配制和樣品處理時選擇避光條件。為減少樣品處理過程中耗費時間長帶來的誤差，也避免樣品中淀粉的干擾，將研磨樣品超聲溶解并離心沉淀除去不溶的淀粉。選擇多個藥片研磨后，然后稱取一個藥片的質量更能保證結果可信度。

2.4.3標準溶液，工作曲線和樣品分析

選擇λex=468.8 nm，λem=524.0 nm調零后測試pH 4.5醋酸溶液配制的維生素B2的標準溶液的熒光強度(表2)，并作工作曲線(圖6)：

If=0.143+116.38C(R=0.999 9)

測得樣品溶液的濃度為0.449 μg/mL 折合每個藥片的維生素B2含量為4.49 mg，與藥片的標示含量(5.0 mg)接近。

表2 標準溶液的熒光強度值

圖6 維生素B2的標準工作曲線

3 結 語

(1) 傳統熒光法測定維生素B2含量的實驗進行改革，在完成了教學任務的同時，提高了學生的自主性和能動性。

(2) 新的實驗設計增加了實驗內容，學生可熟練掌握儀器的性能和使用方法，并將pH計、紫外-可見分光光度計的使用并入其中。起到了綜合利用不同分析方法的效果，加深對不同分析方法的理解。

(3) 實驗前，學生通過資料查閱并實現對測試條件的選擇，每一個步驟和過程都需要認真思考，細心探索，培養了學生獨立思考和分析問題的能力。

(4) 從條件測試、干擾分析到樣品的避光處理，都使得學生將所學知識主動的、多樣化的運用到實踐中。每一步成功都代表著他們實驗操作技能和解決問題能力的提高，使學生在實驗過程中接受創新思維的訓練和創新能力的鍛煉[4]。真正實現了在實驗中探索、提出問題、解決問題；在解決問題中發現、創新，并在創新中得到提高[15]。

(5) 使學生了解科學研究的嚴謹和實事求是，更讓他們知道團隊合作的重要作用[16]。更重要的是這種方式起到從本科教學到科學研究的橋梁作用。

[1] 張建峽，周 紅，徐 云，等. 研究型實驗的理念[J]. 實驗技術與管理，2009, 26(3): 135-136.

Zhang jianxia, Zhou Hong, Xu Yun,etal. The idea of research-oriented experiments[J]. Experimental Technology and Management, 2009, 26(3): 135-136.

[2] 易 紅.高校實驗教學與創新人才培養[J]. 實驗室研究與探索，2008, 27(2): 1-4.

Yi Hong. Experimental Teaching of University and Cultivation of Innovative Talent[J]. Research and Exploration of Laboratory, 2008, 27(2): 1-4.

[3] 凌亞文，華中文，張愛萍，等.開放實驗室的實踐和思考[J]. 實驗室研究與探索，2006, 25(5): 672-673.

Ling Yawen, Hua Zhongwen, Zhang Aiping,etal. Practice and Thinking of the Opening Laboratory[J]. Research and Exploration of Laboratory, 2006, 25(5): 672-673.

[4] 周永生，陳 群，席海濤，等. 色譜開放實驗室管理模式探索與實踐[J]. 實驗室研究與探索，2013, 32(8): 216-219.

Zhou Yongsheng, Chen Qun, Xi Haitao,etal. Exploration and Practice on the Management of Open Chromatograph Laboratory[J]. Research and Exploration of Laboratory, 2013, 32(8): 216-219.

[5] 李英俊，孫淑琴，于世均，等. 多種模式開放實驗室 培養創新人才的探索與實踐[J]. 實驗室研究與探索，2007, 26(3): 121-124.

Li Yingjun, Sun Shuqin, Yu Shijun,etal. Exploration and Practice on Innovative Talents Cultivation by Multiple-Pattern Opening Laboratory[J]. Research and Exploration of Laboratory, 2007, 26(3): 121-124.

[6] 皮建軍，向孫軍，楊其仁，等. 創新實驗教學途徑的探索與實踐[J]. 實驗科學與技術，2007, 5(2): 63-65.

Pi Jianjun, Xiang Sunjun, Yang Qiren,etal. Exploration and Practice in Innovative Experiment Teaching Approaches[J]. Experimental Science and Technology, 2007, 5(2): 63-65.

[7] 葉蔚云，李振波，石煥橋，等. 光黃素熒光法測定食物中核黃素的研究[J]. 廣東藥學院學報，1996, 12(1): 175-177.

Ye Weiyun, Li Zhenbo, Shi Huanqiao,etal. Study on Lumiflavin Fluorimetry for Determination of Riboflavin in Food[J]. Academic Journal of Guangdong College of Pharmacy, 1996, 12(1): 175-177.

[8] 楊萬龍，李文友. 儀器分析實驗[M]. 北京:科學出版社，2008.

[9] 李蘭水，周鳳盈. 維生素B2片含量測定方法中供試品溶液兩種制備方法的比較[J]. 中國藥師, 2013, 16(11): 1745-1746.

Li Lanshui, Zhou Fengying. Comparison of Two Preparation Methods of the Test Solution for the Determination of Vitamin B2Content in Tablets[J]. China Pharmacist, 2013, 16(11): 1745-1746.

[10] 維生素B2化學性質. 百度百科化工空間[引用日期2013-01-15]

[11] 鄭 集，陳均輝. 普通生物化學[M]. 北京:高等教育出版社, 1998.

[12] 中華人民共和國藥典委員會. 中華人民共和國藥典2010年版第二部[M].北京:中國醫藥科技出版社，2012.

[13] 李文釗. 核黃素結晶分離純化研究[D]. 天津:天津大學, 2007.

[14] 李高生，高愛軍. 維生素B2片含量測定方法的改進[J]. 江蘇藥學與臨床研究，2005, 4(13): 61-62.

Li Gaosheng, Gao Aijun. Improvement on the Determination of Vitamin B2Content in Tablets[J]. Jiangsu Pharmaceutical and Clinical Research, 2005, 4(13): 61-62.

[15] 程春英，程梅燕. 淺析高校實驗室開放的建設與管理[J]. 實驗室科學，2012, 15(1): 152-154.

Cheng Chunying, Cheng Meiyan. Analysis on the construction and management of the opening laboratory in college[J]. Laboratory Science, 2012, 15(1): 152-154.

[16] 尹 新，劉子建，劉紅霞.實驗室開放的探索與實踐[J]. 實驗技術與管理，2006, 23(8): 101-103.

Yin Xin, Liu Zijian, Liu Hongxia. Exploration and Practice of Laboratory Opening[J]. Experimental Technology and Management, 23(8): 101-103.