誘導性多能干細胞疾病模型的應用價值

白 雪 王 毅

誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）技術是生命科學研究和醫學領域的一項突破性技術，在疾病研究、個體化治療、再生醫學及模型制備等方面均具有巨大的應用潛力[1]。Takahashi等[2]以逆轉錄病毒為載體，將4種干細胞轉錄因子（Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4）導入小鼠皮膚成纖維細胞，使細胞重編程為具有類似胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）特點的新型細胞，稱為iPSC。Takahashi等[3]又利用4種同樣的轉錄因子將人皮膚成纖維細胞誘導為iPSC。近年來，iPSC研究進展迅速，已獲得了多種來源于人或動物成體細胞的iPSC，特別在iPSC疾病模型的研究方面，取得了重要的研究成果[4]。iPSC技術提供了一個忠實模擬人類疾病的機會，為人類疾病的研究奠定了基礎。本文就iPSC疾病模型的應用價值綜述如下。

1 iPSC疾病模型的優勢

研究者常采用動物模型對疾病的病理機制和治療藥物進行研究。但動物與人類之間存在著生物學差異，許多人類疾病的狀態無法用動物模型模擬，且構建的動物模型很難模擬疾病的個體差異。ESC誕生后，人們嘗試著利用ESC的多潛能分化特性獲得某種疾病的表型，但面臨ESC的倫理問題及疾病表型不易誘發等難題。利用iPSC技術可直接從患者身上獲得所需的研究材料，并且iPSC不受倫理的限制，細胞來源豐富。所獲得的疾病iPSC及其分化的細胞可被廣泛用于疾病的研究。iPSC疾病模型的研究已涉及神經系統、血液系統、心血管系統疾病及糖尿病、肝病和多種遺傳性疾病等，研究內容包括：iPSC的誘導、分化、疾病表型、發病機制探索及藥物試驗等[5-6]。

目前，已有多種具有明確遺傳背景的疾病建立了相應的iPSC疾病模型，一些特異性遺傳性疾病相對容易模擬，更適于采用iPSC技術進行研究[7]。iPSC疾病模型為人們在體外研究疾病提供一個有效的平臺[8]。

2 iPSC疾病模型的建立

iPSC疾病模型包括具有疾病表型的iPSC及其分化細胞，其建立的過程是患者的成體細胞重編程、誘導分化及篩選受疾病影響的效應細胞。重編程方法的發展為iPSC疾病模型的建立奠定了基礎。成體細胞從去分化到重編程為iPSC一般需2~4周。iPSC誘導的本質是使終末分化的細胞重新獲得多能干細胞相似的調控網絡和表觀遺傳學特征，可通過外源性的轉錄因子、小分子化合物及人工激活的信號轉導通路來實現。以逆轉錄病毒和慢病毒為載體，利用轉錄因子Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4的重編程，可能會引起插入突變。Soldner等[9]利用Cre-Loxp系統重編程，在含有重編程基因的慢病毒載體兩端加上loxp位點，隨后載體整合進入成纖維細胞基因組中，重編程后，利用Cre基因的瞬時表達從iPSC中移除重編程因子。移除了重編程因子的iPSC基因表達譜與ESC更為接近，但Cre-Loxp系統重編程介導的基因刪除會導致一段載體DNA留在插入位點上，也無法避免插入突變。Woltjen等[10]將重編程因子插入PiggyBac（PB）轉座子的5′和3′末端重復序列之間，在轉座酶的作用下，PB轉座子整合進入成纖維細胞基因組。重編程以后，PB轉座酶瞬時表達切除PB轉座子，在整合位點不留任何痕跡。PB系統重編程較傳統逆轉錄病毒方法產生iPSC的效率高，且安全。Cre-Loxp和PB系統重編程在操作上要求更多、更嚴格。

Zhou等[11]通過重編程因子的編碼蛋白誘導iPSC形成，該研究將穿膜肽11R（11個精氨酸轉導結構域）與4種轉錄因子蛋白相結合（Oct4-11R、Sox2-11R、Klf4-11R和cMyc-11R），利用小分子物質丙戊酸（VPA）協助刺激，將小鼠胚胎成纖維細胞重編程為iPSC。誘導過程不改變宿主細胞的基因組，安全性高，此方法簡單，缺點是誘導效率低。Warren等[12]采用人工合成的mRNA誘導人體細胞重編程為iPSC，該方法避免了細胞對外源RNA的免疫反應，不損傷細胞的基因組，得到的iPSC與ESC更為相似，其誘導效率是傳統方法的40~100倍，速度也是傳統方法的2倍，是一種安全、有效的誘導方法，有較高的應用價值。Anokye-Danso等[13]首次采用小RNA（microRNAs）對人和鼠的成體細胞進行重編程，在未使用轉錄因子的情況下誘導出iPSC，并成功地分化為生殖細胞，誘導效率提高約100倍。隨著iPSC技術的發展，安全性及誘導效率在不斷提高，非病毒、非整合的誘導方法成為研究的熱點，特別是iPSC安全性問題不但是iPSC臨床應用的前提，也是成功建立iPSC疾病模型的保障。另外，建立iPSC疾病模型還需要有效的定向分化體系及分離純化特定細胞類型的方法，以保證研究結果的準確性和可重復性。

3 iPSC疾病模型的應用

3.1 iPSC疾病模型與病理機制研究 馬凡綜合征（MFS）是一種遺傳性結締組織病，為常染色體顯性遺傳，由編碼細胞外基質蛋白基因FIBRILLIN-1（FBN1）突變引起。MFS患者來源的iPSC能夠像人ESC一樣真實反映該基因疾病。來源于MFS患者的iPSC和來自于攜帶FBN1突變胚胎的ESC均具有FBN1基因突變，均表現出該疾病最為顯著的臨床特征：骨組織形成能力下降，容易形成軟骨；并且證明轉化生長因子（TGF）-β信號激活可導致FBN1突變的患者干細胞向骨的分化受到抑制，當抑制TGF-β信號時，干細胞向骨的分化得以恢復。利用患者的iPSC及其分化細胞在體外構建疾病模型，并進行疾病研究是完全可行的[14]。Ye等[15]將2例骨髓增殖性疾?。∕PD）患者的外周血CD34+細胞轉化為多個iPSC系，這些細胞攜帶MPD特征性的獲得性的JAK2-V617F基因突變，并具有多向分化的能力。在一定條件下使其向造血細胞分化后，表現出紅系造血能力增強和特定基因的表達，這類iPSC提供了研究MPD發病機制的模型。

關于帕金森?。≒D）衰老機制，一直缺乏研究的模型，大多數PD研究利用轉基因小鼠或藥理學小鼠模型，而小鼠的神經生物學特征和衰老過程與人類具有很大的區別。Liu等[16]利用iPSC技術研究了攜帶PD致病基因LRRK2（G2019S）突變患者的神經細胞，首次揭示了核膜異常，以及腦內神經干細胞漸進性功能衰退在PD發生、發展中起重要作用。他們先將攜帶PD致病基因LRRK2（G2019S）突變的患者皮膚細胞誘導為iPSC，再將iPSC定向分化為目前無法從患者顱內直接獲取的功能性神經干細胞及多巴胺神經元，發現LRRK2（G2019S）突變的神經干細胞表現出一系列與“衰老”相關的退行性表型，如對細胞內泛素化蛋白聚集誘導的凋亡更加敏感。隨著體外傳代次數的增加，攜帶基因突變的神經干細胞表現出明顯的核膜異常，如核纖層蛋白組成和核膜結構的改變。為驗證這些新型病理特征與PD致病基因LRRK2突變之間的分子聯系，研究者通過基因打靶技術原位矯正了患者神經干細胞中的LRRK2（G2019S）突變。結果表明，矯正后的神經干細胞與PD相關的疾病表型消除了。相反，利用打靶技術在正常人ESC中定向敲入LRRK2(G2019S)突變，將會導致疾病相關表型的出現。

3.2 iPSC疾病模型與藥物研究 藥物研發中存在的難題是建立合適的模型。目前，最常使用動物模型，但動物模型不但涉及倫理問題，而且動物模型與人類存在遺傳背景、生理及藥物代謝差異等。利用iPSC疾病模型進行藥物研究可避免上述限制，并且可針對不同患者建立iPSC疾病模型，篩選出具有針對性的藥物，真正實現個體化治療。

Riley-Day綜合征是一種罕見的遺傳病，其致病基因為IKBKAP，累及神經細胞，目前，人們很難通過組織學活檢從患者體內取得這種細胞進行研究。Lee等[17]獲得了Riley-Day綜合征患者的皮膚細胞，將其誘導成為iPSC，再使iPSC分化為受到疾病影響的神經細胞（神經嵴前體細胞），構建了iPSC疾病模型，利用該模型進行了大規模的藥物篩選。結果顯示，這些化合物能提高IKBKAP的表達，其中SKF-86466能夠通過調節細胞內PKA依賴的CREB磷酸化和cAMP水平來誘導IKBKAP轉錄，SKF-86466是在細胞水平上逆轉疾病進程的潛在分子。由于一些罕見遺傳疾病很難應用現有的模型進行藥物研發，因此，該成果為一些遺傳疾病提供了成本低、快捷的藥物研發途徑。

Tanaka等[18]報道，使用離子通道抑制劑作用于iPSC分化的心肌細胞，會引起該心肌細胞除極過程的改變，并呈劑量依賴性，與人體原位心肌細胞對離子通道抑制劑的反應一致。Yokoo等[19]研究表明，利用iPSC分化的心肌細胞進行藥物研究具有可行性。Itzhaki等[20]獲取了1例2型先天性QT間歇延長綜合征（LQTS）患者的皮膚成纖維細胞，誘導生成了iPSC。該iPSC具有患者特異的KCNH2基因錯義突變（A614V），將其分化為心肌細胞后，細胞表現出動作電位時程顯著延長，原因是源于心臟外向鉀電流顯著下降。研究者應用該模型對一些治療藥物進行了評估。

利用iPSC分化的肝細胞可用于篩查藥物的肝細胞毒性，有助于藥物的評估。Takayama等[21]檢測了與肝臟發育有關的7種候選基因。發現兩種轉錄因子FOXA2及HNF1α可聯合促進人iPSC及ESC分化為肝細胞。這些細胞具有肝細胞相關的基因表達譜，并且具備原代人類肝細胞的功能及特性。他們利用人iPSC及ESC分化的肝細胞成功地評估了9種藥物引起的細胞毒性。FOXA2及HNF1α是促進人iPSC及ESC分化為肝細胞的有效轉錄因子，對篩查由藥物引起的細胞毒性有重要價值。iPSC誘導和分化技術的發展，將促進iPSC疾病模型的完善和應用。

3.3 iPSC疾病模型與細胞治療研究 iPSC疾病模型的建立為細胞治療奠定了基礎。人們可通過同源重組技術糾正患者iPSC中突變的基因，將其分化為功能細胞，回輸到患者體內，有望徹底治愈疾病。Hanna等[22]第1次證實了基于iPSC的基因矯正可以修復遺傳突變的表型，利用小鼠鐮狀細胞貧血的模型，他們建立了患病小鼠的iPSC，通過同源重組的技術矯正了具有缺陷的血紅蛋白基因。這種經過基因矯正的小鼠iPSC具有體外分化為造血細胞的能力，這些造血細胞經過移植，使得患病小鼠的紅細胞恢復正常功能。已有多種人類疾病特異的iPSC建立，且應用同源重組技術將致病基因修復，這些疾病模型包括：兒童早衰癥、PD、回旋形萎縮癥以及鐮狀細胞貧血、地中海貧血、范科尼貧血和陣發性夜間血紅蛋白尿等[23-25]。在這些研究中，部分iPSC細胞的治療效果已在小鼠中得到驗證[26]。

α1-抗胰蛋白酶（A1AT）基因的點突變（Glu342Lys），可導致患者α1-抗胰蛋白酶缺乏癥（A1ATD），是肝臟和肺最常見的常染色體隱性遺傳病，最終使患者罹患肝硬化和肺氣腫。Yusa等[27]將A1ATD患者的皮膚細胞誘導為iPSC，再利用鋅指核酸酶（ZFNs）剪斷基因突變位置的基因序列，使用PB轉座子將正確的基因插入其中，再將PB轉座子序列從細胞中剔除，在基因修正點未發現DNA被破壞的現象。修正的人iPSC分化為肝臟細胞后，移植到肝功能失調的小鼠體內，證明這種經過修正的基因在其分化的肝臟細胞中非常活躍，能恢復小鼠的肝功能。盡管這些研究還處于初期階段，但已向疾病的個性化治療邁出了成功的一步。

β-地中海貧血是β-珠蛋白鏈合成減少或缺乏導致的一種溶血性遺傳性疾病。其中重型β-地中海貧血常由β-珠蛋白基因發生點突變或小片段缺失造成。Wang等[28]研究了1例確診為重型β-地中海貧血的患兒，其β-珠蛋白基因突變為純合子β-41/42缺失，運用iPSC技術將患兒成體細胞誘導為十幾株iPSC系，并對其中4株iPSC系進行多能性鑒定。通過同源重組技術修復了iPSC突變的位點，并將其分化為造血祖細胞，移植到免疫缺陷小鼠模型體內，該小鼠模型在放射性照射后，其紅細胞及血紅蛋白水平能較快恢復到正常水平，并產生出正常β-珠蛋白。iPSC技術結合基因打靶是潛在治療遺傳性疾病的手段。

另外，用于iPSC疾病模型的基因修復有兩個方案，一是修復來源細胞的異?；颍垣@得健康的iPSC及其分化細胞；或者修復iPSC異?；颍佾@得基因正常的分化細胞。iPSC的基因修復為將來人類的細胞移植治療奠定了基礎。

4 iPSC疾病模型的局限性及解決方案

Soldner等[29]認為，單個iPSC系顯示出高度差異的生物學特性，使人們難以預測它們分化為特異功能性細胞類型的傾向，限制了研究疾病特異性表型的價值。導致這些細胞間差異的原因大致分為3類：重編程過程造成細胞的改變；缺乏完善的分化實驗方案導致培養誘導的差異；遺傳背景的差異。如果將載體整合到宿主基因組中，則由重編程引起的細胞改變問題會更嚴重。因此，采用更先進的非整合性重編程技術，如質粒、mRNA轉染及蛋白質轉導。改善培養條件，執行更嚴格的質量控制，將能解決這些問題。

iPSC缺乏完善的體外分化方案，大部分方案均依賴于正常胚胎發育特殊階段發揮重要作用的生長因子信號和調控因子。盡管這些方案較為有效，但它們通常生成的是不同細胞類型的混合物，當研究目標是構建高度受控的疾病模型時，這將是一個極大的限制。因此，導入受到譜系或細胞類型特異性啟動子控制的報告基因或選擇基因，可使研究者能夠鑒別、篩選特異的細胞類型。另外，遺傳變異對于基因表達的重要影響在個體間存在差異。當患者與健康供體間不具有相同的遺傳背景或僅具有部分的遺傳背景時，將患者來源的iPSC系與來自健康供體的iPSC系進行比較，以推測與疾病相關的表型時會有相當大的風險[29]。

[1]Teoh HK,Cheong SK.Induced pluripotent stem cells in research and therapy[J].Malays J Pathol,2012,34(1):1-13.

[2] Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[3]Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.

[4]Lan F,Lee AS,Liang P,et al.Abnormal calcium handling proper?ties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in pa?tient-specific induced pluripotent stem cells[J].Cell Stem Cell,2013,12(1):101-113.

[5]Liu GH,Qu J,Suzuki K,et al.Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2[J].Nature,2012,491(7425):603-607.

[6] Kim C,Wong J,Wen J,et al.Studying arrhythmogenic right ventric?ular dysplasia with patient-specific iPSCs[J].Nature,2013,494(7435):105-110.

[7] Nguyen HN,Byers B,Cord B,et al.LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress[J].Cell Stem Cell,2011,8(3):267-280.

[8] Egashira T,Yuasa S,Fukuda K.Novel insights into disease model?ing using induced pluripotent stem cells[J].Biol Pharm Bull,2013,36(2):182-188.

[9] Soldner F,Hockemeyer D,Beard C,Parkinson’s disease patientderived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors[J].Cell,2009,136(5):964-977.

[10]Woltjen K,Michael IP,Mohseni P,et al.PiggyBac transposition re?programs fibroblasts to induced pluripotent stem cells[J].Nature,2009,458(7239):766-770.

[11]Zhou H，Wu S，Joo JY，et al.Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins[J].Cell Stem Cell,2009,4(5):381-384．

[12]Warren L,Manos PD,Ahfeldt T,et al.Highly efficient reprogram?ming to pluripo-tency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA[J].Cell Stem Cell,2010,7(5):618-630.

[13]Anokye-Danso F,Trivedi CM,Juhr D,et al.Highly efficient miR?NA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency[J].Cell Stem Cell,2011,8(4):376-388.

[14]Quarto N,Leonard B,Li S,et al.Skeletogenic phenotype of human Marfan embryonic stem cells faithfully phenocopied by patient-spe?cific induced-pluripotent stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(1):215-220.

[15]Ye Z，Zhan H，Mall P，et al.Human-induced pluripotent stem cells from blood cells of healthy donors and patients with acquired blood disorders[J].Blood,2009,114(27):5473-5480.

[16]Liu GH,Qu J,Suzuki K,et al.Progressive degeneration of human neural stem Cells caused by pathogenic LRRK2[J].Nature,2012,491(7425):603-607.

[17]Lee G,Ramirez CN,Kim H,et al.Large-scale screening using fa?milial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies com?pounds that rescue IKBKAP expression[J].Nat Biotechnol,2012,30(12):1244-1248.

[18]Tanaka T,Tohyama S,Murata M,et al.In vitro pharmacologic test?ing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyo?cytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,385(4):497-502.

[19]Yokoo N,Baba S,Kaichi S,et al.The effects of cardioactive drugs on cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,387(3):482-488.

[20]Itzhaki I,Maizels L,Huber I,et al.Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells[J].Nature，2011,471(7337):225-229.

[21]Takayama K,Inamura M,Kawabata K,et al.Generation of metaboli?cally functioning hepatocytes from human pluripotent stem cells by FOXA2 and HNF1α transduction[J].J Hepatol,2012,57(3):628-636.

[22]Hanna J,Wernig M,Markoulaki S,et al.Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin[J].Science,2007,318(5858):1920-1923.

[23]Liu GH,Barkho BZ,Ruiz S,et al.Recapitulation of premature age?ing with iPSCs from Hutchinson-Gilford progeria syndrome[J].Na?ture,2011,472(7342):221-225.

[24]Soldner F,Laganiere J,Cheng AW,et al.Generation of isogenic plu?ripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations[J].Cell,2011,146(2):318-331.

[25]Sebastiano V,Maeder ML,Angstman JF,et al.In situ genetic correc?tion of the sickle cell anemia mutation in human induced pluripo?tent stem cells using engineered zinc finger nucleases[J].Stem Cells,2011,29(11):1717-1726.

[26]Hargus G,Cooper O,Deleidi M,et al.Differentiated Parkinson pa?tient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult ro?dent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(36):15921-15926.

[27]Yusa K,Rashid ST,Strick-Marchand H,et al.Targeted gene correc?tion of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells[J].Nature,2011,478(7369):391-394.

[28]Wang Y,Zheng CG,Jiang Y,et al.Genetic correction of β-thalasse?mia patient-specific iPS cells and its use in improving hemoglobin production in irradiated SCID mice[J].Cell Res,2012,22(4):637-648.

[29]Soldner F,Jaenisch R.Medicine.iPSC disease modeling[J].Sci?ence,2012,338(6111):1155-1156.