“中藥色譜分析綜合實驗”創新課程教學探索

周婷婷， 聞 俊， 趙衛權， 洪戰英， 趙 鑫， 范國榮

(1. 第二軍醫大學 藥學院，上海 200433；2. 上海市藥物(中藥)代謝產物研究重點實驗室，上海 200433)

0 引 言

分析化學是關于研究物質的組成、含量、結構和形態等化學信息的分析方法及相關理論的一門科學，其理論知識和實驗技能是藥物分析學、藥物化學、天然藥物化學、中藥學等各個學科的必備基礎，是藥學專業基礎化學課程之一[1]。分析化學以解決實際問題為目的，實踐性、應用性較強，因此配合理論教學所開設的分析化學實驗可以鞏固加深學生對分析化學基本概念和理論的理解，同時又使得學生可以運用所學的知識指導實驗過程、解釋實驗現象和解決實驗中的問題，做到理論聯系實際。

針對藥學專業學生的分析化學教學，多采用藥物為對象進行理論和實驗講授，以在低年級階段讓學生接觸藥物的概念，盡早的強化學生藥學專業思想，即所學的理論知識與實驗技術是用來解決藥物研究的實際問題。從這個角度出發，實驗教學不應該全部以獨立的實驗項目進行訓練，可以采用模塊化的實驗教學形式，以解決實際問題為目的，合理進行教學設計，有機組合實驗技術，突出科學實踐過程，在訓練學生實驗技能的基礎上，有效的訓練學生科研思維，增加學生專業興趣[2-4]。因此，我們改進了色譜分析實驗教學內容，建立了以“中藥有效成分提取分離及分析”為主的色譜分析模塊的綜合實驗，并且在近7屆學生中進行了教學實踐加以不斷完善，達到了較好的教學效果，構建了以提高學生分析問題、解決問題能力和增加專業學習興趣的模塊化實驗教學新模式。

1 色譜分析教學模塊

分析化學中色譜分析教學模塊主要由色譜分析概論、氣相色譜法、高效液相色譜法、平面色譜法組成，其中概論部分以經典的柱色譜為例，講授了色譜流出曲線、分離機制和色譜基本理論；各論中以各個色譜法的原理與應用特點為主進行講解。“是什么？能做什么？”是教師通過課堂教學后，期望告訴學生的內容。其中“能做什么？”的答案則是以模塊化的中藥色譜分析為面貌展現在學生面前，結合理論課中“是什么？”的原理探討，使學生在實驗中增加對儀器使用和方法應用的直觀認知過程[5-6]。

根據理論課教學中需要掌握的方法原理與實驗技術，我們將色譜實驗分為柱色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法4個實驗項目。模塊化的綜合實驗則是基于中藥分析這一實驗過程提出的，中藥分析中如何將上述4種實驗技術有機結合，在教學設計中需要老師仔細考慮。根據教學組多年來“科研反哺教學”這一教學理念，結合教研室在中藥質量控制中的研究技術與科研成果[7-14]，我們提出以“中藥有效成分提取分離及分析”為實驗教學要求的中藥色譜分析綜合實驗，形成了“柱色譜法分離純化中藥有效部位”，“薄層色譜法鑒識粗提物及有效部位中活性成分”，“氣相色譜法檢查有效部位中有機溶劑殘留量”，“高效液相色譜法測定有效部位及藥材中活性成分含量”這4個前后聯系，以解決中藥分析問題為主線的創新型教學設計。創新的模塊化實驗教學不僅對4種色譜實驗技術進行綜合運用，而且還囊括了分離制備、定性和定量分析這些應用特點，同時也給學生一些科研實踐的思考：柱色譜分離純化過程對有效部位中活性成分含量是否有影響？有機溶劑殘留主要和哪幾個步驟有關？有效部位和藥材中活性成分含量為何會有不同？這些都能夠激發學生的探求欲和主觀能動性，初步具備實踐研究的思維特點。

2 藥材及實驗方法的綜合選擇

中藥屬于藥物分析中的復雜體系，色譜法以其分離分析的特點，當仁不讓的成為中藥分析的首選方法。但是我國中藥材種類豐富，其中所含的活性成分也千差萬別，具體實驗方法也不盡相同，因此教學組老師從自身科研角度出發，同時也綜合考慮學生實驗過程中的課時安排、儀器與試劑使用、對照品價格等問題，篩選了實驗室研究較多的中藥為對象，表1列出了該實驗中選擇的藥材及實驗方法。

學生實驗與科研過程存在區別。如何在有限的教學時數、設備資源配置和教學經費投入中，獲得預期的教學目標，提高教學質量，是教學設計者需要考慮的問題。在最初的實驗教學中，我們分別在3個不同年級中嘗試了采用辛夷、金蓮花和山楂葉進行有效成分的分離純化、定性定量分析。雖然整個教學過程可以完整的實施，但是其中的問題卻反映出“科研反哺教學”這一理念在付諸實踐時，還需要符合本科生的認知程度和實驗教學的要求。

辛夷中的木脂素成分極性較小，采用大孔吸附樹脂分離純化，需要60%～90%的乙醇才能洗脫，柱色譜分離時間變長；為了保證高效液相色譜基線分離，針對松脂素二甲醚選擇的流動相體系使得整個分析時間為30 min。金蓮花和山楂葉純化后的總黃酮有效部位中除了表1中所列主要活性成分外，還有較多的其他黃酮苷類成分，成分越多色譜方法優化就越復雜，條件也會更加苛刻。例如金蓮花總黃酮有效部位中葒草苷定量分析，高效液相色譜流動相組成復雜，不僅學生配制過程容易出錯，而且較長的分析周期也使得實驗變得冗長。除此以外，對照品獲得成本也需要考慮在實驗中。由于學生實驗需要自行配制工作曲線溶液，因此葒草苷與牡荊素鼠李糖苷化學對照品總量的成本顯得相當高，而自制對照品的成本與周期也并不省時省力，從效率說上考慮，實驗教學的有效性便大打折扣。

表1 中藥色譜分析模塊綜合實驗藥材與主要實驗方法

*氣相色譜條件：色譜柱：SPB-1(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱，初始柱溫50 ℃；程序升溫：50 ℃恒溫3 min，而后40 ℃/min升溫至230 ℃，并維持5 min；進樣口溫度230 ℃；FID檢測，檢測器溫度250 ℃；以高純氮為載氣，柱前壓力為48 kPa，分流比為30∶1；溶液直接進樣，進樣量為0.5 μL

**色譜柱規格為150 mm×4.6 mm，5 μm，流速為1.0 mL/min，進樣量20 μL；分析周期指“對照品”分析周期

相比之下，梔子純化后得到的有效部位成分簡單，其中梔子苷含量達到了60%以上，薄層色譜條件可以直接采用藥典的方法，高效液相色譜法流動相組成簡單，分析周期短。實驗室擁有梔子苷單體制備的專利[13]，而且每個年級實驗教學后收集的剩余有效部位經過進一步簡單制備后又可以得到梔子苷對照品，如此循環利用不僅避免了藥材浪費，還獲得了更多的梔子苷對照品，使得實驗教學具有可持續性。因此從藥學本科2007年級開始至今，我們便選擇梔子藥材中總環烯醚萜苷類有效成分分離純化和定性定量分析為教學內容，進行中藥色譜分析模塊綜合實驗教學，通過不斷的完善，目前已經基本可以滿足教學要求，取得了較大的教學效果。

3 實驗設計

3.1 梔子中環烯醚萜苷類成分的提取及柱色譜法分離純化

干燥梔子藥材100 g，用10倍量50%乙醇80 ℃回流提取兩次，每次2 h，過濾，合并濾液，40℃減壓濃縮至120 mL，離心除去沉淀，得到含有梔子環烯醚萜苷有效部位的提取液(預留10 mL供以后實驗使用)。上述步驟由老師提前完成。取剩余提取液，加入裝有400 g經過預處理的1 300大孔吸附樹脂層析柱上，上樣完畢后吸附1 h。用1 000 mL水進行淋洗，淋洗液棄去。再用3 000 mL 20%乙醇洗脫，收集洗脫液減壓濃縮，真空干燥(60 ℃)，得環烯醚萜苷有效部位固體產品。環烯醚萜苷有效部位得率=(固體產品重量÷藥材重量)×100%。

實驗采用內徑為3 cm的玻璃柱，樹脂填裝應均勻緊密；上樣時注意防止樣品快速傾倒下沖起樹脂產生柱內氣泡，影響分離效果。運用乙醇密度計測定所配制的乙醇的濃度；淋洗及洗脫過程需要控制流速，一般為25～30 mL/min，防止流速太快造成淋洗或洗脫不完全，帶入較多雜質，降低產品得率。

3.2 梔子中環烯醚萜苷類成分的薄層色譜法鑒別

取硅膠粉末5 g于研缽中，分多次加入0.5% CMC-Na溶液10 mL，每次加入后充分研勻，調成糊狀，均勻涂布在玻璃板上，置水平臺面上于室溫下晾干，再在105 ℃烘箱中活化60 min，儲于干燥器中備用。上述步驟在前一個實驗的樣品吸附1 h期間完成。

分別將梔子藥材粗提液和有效部位用50%甲醇溶解并稀釋成約相當于原藥材200 mg/mL的供試品溶液，梔子苷對照品用乙醇溶解配制成約4 mg/mL的濃度，作為對照品溶液。取供試品溶液及對照品溶液，分別點于自制硅膠上，點樣基線距薄層板底邊2 cm，點樣原點直徑應小于2 mm，各樣品原點之間間距1.5 cm以上，點樣量約5 μL。另取市售硅膠板，同法操作。

按照乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)比例配制展開劑，倒入層析缸內，待點樣后斑點溶劑揮干后，將薄層板放入層析缸內飽和15 min，而后將薄層板下緣浸入展開劑中約0.5～1 cm(展開劑切勿浸沒樣品原點)，展開約20～30 min后取出，標記展開劑前沿，放在空氣中揮干。展開劑揮干后，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃烘箱內加熱至斑點清晰。

比較供試品和對照品展開后的斑點，測量計算Rf值。

3.3 高效液相色譜法測定梔子藥材及其提取物中梔子苷的含量

配制500 ml流動相，比例為乙腈-1%醋酸水(15∶85)，色譜柱為ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，設置色譜儀條件為流速1.0 ml/min，室溫，檢測波長238 nm，進樣量20 μl。

取梔子苷對照品，精密稱定，用50%甲醇配制約1 mg/mL對照品儲備液；取梔子苷儲備液適量，置5 mL量瓶中，用流動相稀釋并定容，制成濃度為10、20、40、60、80 μg/mL的梔子苷對照品工作曲線系列溶液。

精密量取梔子藥材提取液適量，置10 mL量瓶中，用流動相稀釋并定容；精密稱定有效部位粉末適量，置10 mL量瓶中，用流動相稀釋并定容，制成相當于原藥材2 mg/mL的供試品溶液。臨用前用0.45 μm微孔濾膜過濾。

在上述色譜條件下，依次進樣工作曲線溶液，以對照品溶液的濃度(c)和相應的色譜峰面積(A)，擬合A-c工作曲線，求算回歸方程及相關系數。進樣供試品溶液，分別將色譜峰面積代入回歸方程中，求算濃度，并進而求算藥材及有效部位中梔子苷的含量，梔子苷經過大孔吸附樹脂分離純化后的得率。

3.4 氣相色譜法檢查梔子環烯醚萜苷類有效部位中的殘留溶劑

氣相色譜實驗條件為色譜柱：SPB-1(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱，初始柱溫50 ℃，程序升溫：50 ℃恒溫3 min，而后40 ℃/min升溫至230 ℃，并維持5 min；進樣口溫度230 ℃；FID檢測，檢測器溫度250 ℃；以高純氮為載氣，柱前壓力為48 kPa，分流比為30∶11；溶液直接進樣，進樣量為0.5 μL。

精密稱取乙醇、正丁醇適量，用N, N-二甲基甲酰胺為溶劑，分別配制乙醇與正丁醇儲備液約10 mg/mL。分別量取上述二者儲備液適量，置同一10 mL量瓶中，用N, N-二甲基甲酰胺稀釋并定容，制成乙醇和正丁醇濃度均為0.5 mg/mL的對照品溶液。

精密稱取梔子有效部位適量，置10 mL量瓶，并同時精密加入正丁醇儲備液適量，用N, N-二甲基甲酰胺稀釋并定容，制成梔子環烯醚萜苷有效部位0.1 g/mL和正丁醇0.5 mg/mL的供試品溶液。

按上述色譜條件進樣檢測，峰面積內標法計算梔子有效部位中乙醇殘留量，檢查有機溶劑殘留是否符合標準。

4 實驗實施

上述每個實驗教學時間安排為4學時，根據實驗室現有儀器設備數量，學生分組實施實驗項目，每組5～8人為宜。按照中藥有效成分提取分離、定性定量分析的順序，所有小組同時開展實驗，每次完成1個項目。每個實驗組安排1名老師和1名高年級研究生帶教，同時印發儀器使用基本操作規程，以幫助學生掌握色譜儀器的基本使用。

為了盡可能減少4個色譜實驗以外的因素影響有效部位提取效率，結合實驗教學時數安排，由老師在課前，根據學生分組個數，放大量統一完成梔子藥材提取。學生柱色譜中獲得的3 000 mL 20%乙醇洗脫液，則由老師在課后分別減壓濃縮，制備成有效部位固體粉末，此粉末即為后續色譜分析實驗的供試品之一，其得率由學生課堂內自行計算。

實驗過程中強調認真記錄原始記錄，包括與柱色譜分離相關的洗脫液的體積和流速，淋洗及洗脫過程中層析柱上顏色的變化；薄層色譜法中點樣體積、展開時間、點樣原點到斑點的距離；高效液相色譜法中柱壓的變化、分析對象的保留時間和峰面積；氣相色譜法中載氣、氫氣和空氣的壓力及流速，溫度變化與待測成分保留時間，色譜峰面積等。詳實的記錄一方面可以讓學生了解色譜分析中的關鍵步驟，一方面便于在最后比較各組結果時，找出各組間結果不同的原因。

5 實驗結果

以2010年級本科某組實驗結果為例：100 g梔子果實藥材，經過50%乙醇回流提取，并經過大孔吸附樹脂分離純化后得到棕色的環烯醚萜苷有效部位5.301 g。薄層色譜法鑒別結果顯示，梔子果實粗提液及環烯醚萜苷有效部位的薄層色譜圖中均顯示與梔子苷位置相同，顏色相近的斑點，表明粗提液和有效部位中含有梔子苷。自制硅膠板與商品化硅膠板的結果一致。

采用高效液相色譜法測定梔子果實粗提液及環烯醚萜苷有效部位中梔子苷含量，在上述色譜條件下，梔子苷保留時間約為5.2 min，理論塔板數大于3 000。以梔子苷對照品溶液濃度(c，μg/mL)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，求得梔子苷的線性回歸方程為：A=6 262c-288，r=0.999 9，表明梔子苷在10～80 μg/mL范圍內線性關系良好。計算得出梔子果實藥材中梔子苷含量為39.1 mg/g，環烯醚萜苷有效部位中梔子苷含量為591.7 mg/g，其中以梔子苷計算轉移率為80.4%。采用氣相色譜法測定環烯醚萜苷有效部位中乙醇殘留量，采用內標峰面積比值法測定，有效部位中乙醇殘留量小于0.5%，結果合格。

根據實驗結果，教師要求每個同學按照期刊論文的格式撰寫一篇研究論文，其中柱色譜分離純化模塊屬于藥材提取部分，必須寫入論文，其余的3個模塊則由同學自由選擇組合后寫入論文中。論文完成后學生還需要根據實驗結果及實驗過程中遇到的問題制作實驗研究電子幻燈進行匯報，對中藥提取分離及色譜定性、定量分析進行深入的探討與交流。特別是針對實驗結果與標準結果相差較大的實驗小組，在匯報交流過程中與學生一起進行溯源式分析，提出可能影響結果的實驗操作步驟，在對色譜綜合分析具有直觀而整體印象的基礎上，再進行每個色譜技術的回顧，使專業知識的掌握與應用更加牢固。

6 結 語

中藥色譜分析綜合實驗充分考慮了學生學習過程的需求，從色譜理論出發層層遞進，以不同的色譜實驗技術為手段，中藥為研究對象，以解決實際問題為出發點，為本科生提供了一個全面而扎實的實驗教學平臺。特別是教學組在中藥質量控制等科研工作上的優勢積累，反哺于本科生的實驗教學中[15]，在強化藥學專業思想的同時，也使學生在類科研的環境中進行綜合性實驗，不僅訓練了學生色譜分析的實驗技能，而且提高了學生綜合運用知識分析問題和解決問題的能力，更能夠提升學生對專業領域內熱點的興趣，為今后專業課程的研修和實踐，奠定了良好的理論基礎與實驗技能。

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