藥用植物細胞懸浮培養產生次生代謝產物的研究進展*

劉 群，李天祥，李慶和，張伯禮

（天津中醫藥大學，天津 300193）

·綜述·

藥用植物細胞懸浮培養產生次生代謝產物的研究進展*

劉 群，李天祥，李慶和，張伯禮

（天津中醫藥大學，天津 300193）

細胞懸浮培養；次生代謝產物；研究進展

自20世紀50年代至今，植物細胞培養技術取得了重大的發展。目前被研究的植物有1 000多種，獲得天然活性產物達500多種[1]。細胞懸浮培養是植物細胞培養技術的應用和發展，中國已建立了人參、西洋參、紫草等藥用植物細胞懸浮培養體系，有效成分含量已達到或超過原植株[2]。

1 影響次生代謝產物積累的培養條件

1.1 愈傷組織及其接種量 生長力旺盛、表面顆粒突起、質地疏松、淡黃色的胚性愈傷組織是建立細胞懸浮系和提高次生代謝產物積累量的基礎[3]。

懸浮細胞的生長具有群聚效應，細胞密度低，生長緩慢；細胞密度高，生長迅速，液泡變大，易積累有害物質，不利于懸浮細胞系的建立[4]。一般藥用植物細胞懸浮培養的接種量在20.0～100.0 g/L。接種量的大小不僅影響細胞的生長量，也影響次生代謝的積累。王關林等[5]發現，在同一培養天數不同接種量的梔子懸浮細胞的收獲量不同，而且在指數后期和靜止期多糖含量顯著下降。

1.2 培養基 培養基中的碳源、氮源、維生素、氨基酸以及植物生長激素等組成成分也影響了植物細胞的生長和代謝。

1.2.1 碳源 在藥用植物細胞懸浮培養過程中最常用為蔗糖，濃度為2%～5%。提高藥用植物細胞生長的碳源濃度，并不一定相應促進其次生代謝產物的積累。郭肖紅等[6]發現，30 g/L蔗糖可使丹參不定根增殖倍數最高，60 g/L蔗糖最適合丹參酮ⅡA合成，低質量濃度蔗糖更利于原兒茶醛合成。

不同種類的碳源對植物細胞代謝有不同的影響。彭昕等[7]研究三葉青細胞懸浮培養發現以5%麥芽糖為碳源時細胞增殖倍數最高；以5%蔗糖為碳源時總黃酮含量最高。因此，應根據不同研究目的來篩選碳源的種類和濃度。

1.2.2 氮源 一般情況下，硝態氮水平高利于細胞增殖和胚性愈傷組織的誘導，銨態氮水平高促進組織的器官分化和體細胞胚胎形成[8]。高艷麗等[9]發現，硝態氮和銨態氮比例為5∶1時，甘草細胞獲最大生物量，以銨態氮為氮源，黃酮類含量最高。

1.2.3 植物生長激素 生長素與細胞分裂素比值適中時,促進愈傷組織生長[10]。激素種類和配比對植物細胞的生長和次生代謝產物的積累有著顯著的影響。Zhao J等[11]在玫瑰紅細胞懸浮培養過程中發現，吲哚-3-乙酸（IAA）與激動素（KT）或6-芐胺基腺嘌呤（6-BA）的組合更利于提高生物堿含量。李蕤等[12]研究發現當6-芐胺基腺嘌呤（6-BA）與吲哚-3-乙酸（IAA）為1.0∶0.4時細胞收獲量最大。

1.3 物理因素的培養條件 在懸浮培養過程中，光照、溫度、pH值、搖床轉速、細胞生長周期等也不容忽視。

1.3.1 光照 光照通過光合作用和光形態建成這兩種途徑影響黃酮類、蒽醌類等次生代謝物的積累[13]。一般所需光強在1 000～2 000 lx，光照時間為每天14 h。光照強度的大小和光質應根據不同植物和研究目的來選擇。李春斌等[14]發現，在2 000 lx光強范圍內，銀杏細胞增長隨光強的加大而增強，光強大于2 000 lx時，有下降趨勢，但培養物中黃酮的含量卻隨光強的增加而增加。另外，紅光最利于銀杏細胞的生長，但黃酮含量最低，藍光下細胞生長最慢，白光下細胞的生物量和黃酮含量居中。

1.3.2 pH值 目前研究認為pH值影響培養細胞的質膜透性、細胞呼吸代謝及胞內離子競爭等[15]。細胞懸浮培養所需pH值為5.5～6.0。不同的pH值對細胞內不同有效物質的積累影響是不一樣的，王娟等[13]研究發現較低的pH值有利于人參皂苷Rb1的合成，較高的pH值有利于西洋參多糖的合成。

1.3.3 溫度 溫度過高或過低都不利于植物細胞的生長和次生代謝產物的積累。在研究主要因素對菘藍下胚軸細胞懸浮培養影響的過程中，發現溫度的影響最大，20℃為最適溫度[16]。

1.3.4 搖床轉速 搖床轉速對細胞生長也有一定的影響。研究發現[17]，長春花愈傷組織細胞120 r/min轉速下20 d后的平均值鮮重最大。

1.4 細胞培養周期 藥用植物細胞的培養生長周期呈“S”型曲線，培養周期一般為14～20 d[18]。次生代謝產物的合成量也會隨細胞不同生長期而改變，一般是同步的，華萍等[19]發現茶葉細胞生長和茶氨酸積累高峰期在第19天～第22天出現，以培養19～22d為宜。

2 提高次生代謝產物積累的方法

2.1 誘導子的加入 誘導子為能引起植物胞內代謝趨向于向次生代謝產物合成方向轉變的脅迫因子[20]。一種誘導子的添加不一定對同一種植物的多種次生代謝產物的積累都起到促進作用。研究顯示[21]，茉莉酸甲酯的添加對葡萄的總酚和白藜蘆醇的含量的提高都有促進作用，但對花青素的含量有抑制作用。趙微等[22]發現高溫和低溫均顯著促進了白樺總三萜的合成和丙二醛的積累。

2.2 前體化合物的加入 在細胞懸浮培養中加入次生代謝產物的前體化合物對提高代謝產物的產量是非常有效的[23]。加入前體物質異戊二烯、牻牛兒醇對銀杏懸浮細胞的生長及銀杏內酯B的積累均有一定的促進作用[24]。

2.3 培養方法的改進 在植物細胞培養過程中，還可以建立有效的培養方法來獲得高產量有效物質。

2.3.1 發狀根培養 發狀根是植物受到發根農桿菌的侵染時產生的呈發狀分支的不定根[25]。發狀根生長迅速，產生的次生代謝產物的含量高[26]。研究表明[27]，發狀根中的總生物堿含量高于長春花的原植株和愈傷組織。發狀根培養具有生長迅速、激素自養、次生代謝產物穩定且往往比植物自身合成的含量還要高等多方面的優點[28]。但是大多數單子葉植物受發根農桿菌感染后不能產生發狀根。

2.3.2 兩相培養 兩相培養是通過細胞在水相中生長，合成的脂溶性次生代謝物質可以轉移至有機相中來提高代謝物的量。目前運用較多的是兩液相培養[29]。吳兆亮等[30]研究表明，在懸浮培養過程中加入有機溶劑可使紅豆杉的紫杉醇的釋放率提高近2倍。

2.3.3 基因工程的應用 利用基因工程技術對植物細胞體內基因進行調控來提高代謝產物產量是目前一種先進的應用方法。通過反義技術，可以將反義DNA或RNA片段導入植物細胞，使控制代謝的關鍵酶活性受調控，從而提高目的物的含量[31]。在薄荷中導入反義構建的薄荷呋喃合成酶基因，降低了薄荷油中薄荷呋喃的含量，改善了薄荷油的品質[32]。

3 討論

經過近幾十年的發展，植物細胞培養技術日趨成熟，人參產生的人參皂苷、紫草產生的紫草寧、黃連產生的小檗堿等已經通過植物細胞培養技術實現了工業化生產[33]。但高產而又穩定的細胞系難以篩選；植物細胞的生長周期過長，以及污染和褐化問題難以徹底解決；植物細胞要求的生長環境復雜，生物細胞反應器工藝難以滿足工業化生產要求；植物細胞培養成本高，但代謝產物含量不穩定，其不一定高于原植物，某些植物細胞次生代謝信號調控十分復雜[34]，難以控制。可見，利用植物細胞培養產生有效次生代謝產物的技術有待進一步完善。

4 展望

放眼未來，利用植物細胞培養技術快速生產有效代謝產物的方法將會有廣闊的發展空間。要想實現植物細胞培養的工業化，需要從以下方面努力：獲取和篩選高產，穩定的細胞系；探索并掌握植物細胞次生代謝信號調控機制，合理、準確地調控其懸浮細胞生長和代謝，以提高代謝產物產量；改善植物生物反應器的工藝和技術，提供植物細胞培養的最適環境；充分利用基因工程先進技術，對次生代謝中的關鍵酶基因進行修飾和改造，提高次生代謝物的產量[35]。無疑，通過上述途徑，在不久的將來，成熟的細胞培養工業化生產體系能為人類防治疾病提供豐富的物質基礎。

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R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0375-03

2014-08-17）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.16

天津市科技支撐計劃項目（10ZCZDSY12400）。

劉 群（1989-），女，碩士研究生，研究方向為中藥質量控制與資源開發。

李天祥，E-mail:litianxiang612@sina.com。