天麻素改變大鼠竇房結細胞和心房肌細胞的電生理活動

王 飛，位 凱，沈 兵，王烈成，孔德虎，胡金蘭

天麻素改變大鼠竇房結細胞和心房肌細胞的電生理活動

王 飛，位 凱，沈 兵，王烈成，孔德虎，胡金蘭

目的記錄大鼠心肌細胞生物電活動并觀察天麻素對大鼠心肌細胞生物電活動的影響。方法選用健康SD大鼠，應用心肌細胞內生物電記錄的方法，了解正常竇房結及心房肌細胞的生物電活動情況，觀察并分析天麻素對大鼠竇房結和心房肌細胞生物電活動的影響。結果在目前實驗條件下，能真實記錄到竇房結和心房肌細胞電活動，在此基礎上觀察到天麻素能加快大鼠竇房結細胞Vmax 4，縮短心房肌細胞APD90，其余的電生理參數變化不明顯。結論記錄離體心肌細胞生物電活動的實驗條件相對成熟；天麻素能影響離體心肌細胞生物電活動，可能與天麻素增強TCa2＋通道通透性，促進KATP的開放有關。

天麻素；心房肌細胞；竇房結細胞；動作電位

天麻作為我國常用的名貴中藥有著巨大的藥用價值，天麻素是其有效成分之一，化學結構為4-羥甲基苯甲醇-β-D吡喃葡萄糖苷。研究［1－2］表明，天麻素具有鎮靜、催眠，對腦細胞損傷有保護作用；對于循環系統，天麻素能降低外周血管阻力、降低血壓和增加動脈血管順應性［3］，尤其可以增加外周及冠狀動脈血流量，對心臟具有一定的保護作用［4］。實驗室前期研究［5］表明天麻素預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，能加快大鼠心率，降低在體大鼠心肌缺血再灌注損傷時心律失常的發生。因此該研究擬從電生理學的角度，探索天麻素對大鼠離體心肌細胞電活動的影響，進而了解天麻素對心肌細胞的離子作用機制，這也將成為研究天麻素降低心律失常發生的必要前提。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用健康成年SPF級SD大鼠（安徽省實驗動物中心提供），雌雄不拘，體重（230± 10）g，動物置于聚丙乙烯塑料大鼠籠內，所有大鼠自由進食飲水，自然采光，室溫維持在（24±1）℃。在實驗過程中，其中有5只大鼠記錄不到竇房結細胞動作電位而舍棄。部分細胞可以記錄到動作電位，但由于不穩定，不能給藥用作藥物灌流前后數據的分析。

1.2 方法

1.2.1 大鼠離體心肌組織的制備 將大鼠擊昏，頸部放血，四肢固定，迅速開胸取右心房連同上下腔靜脈，置于4℃的充氧Krebs’液［118×10－3mol/L NaCl，4.7×10－3mol/L KCl，2.5×10－3mol/L CaCl2，1.2×10－3mol/L KH2PO4，1.2×10－3mol/L MgSO4（7 H2O），25.2×10－3mol/L NaHCO3，11.1 ×10－3mol/L glucose］中，按心臟跳動節律輕擠壓以排除心房內的積血。切取部分上下腔靜脈連同部分心房肌，用不銹鋼針將標本固定在容積為4 ml標本槽中，固定標本過程中注意不能損傷竇房結，并以心肌標本的自然長度固定在光滑的瓊脂表面。用正常Krebs’液灌流［（36±0.5）℃，95%O2、5%CO2的混合氣），恒速灌流（5×10－3L/min）。適應灌流30 min后，記錄竇房結及心房肌細胞生物電各參數。

1.2.2 主要試劑及記錄裝置 天麻素（C13H18O7，批號：20100801，純度：99.2%，江蘇寶澤堂醫藥科技有限公司），其它試劑均為分析純。適應灌流30 min后（LEAD-2蠕動泵，保定蘭格恒流泵有限公司），在顯微鏡下用微操縱儀將玻璃微電極（玻璃微電極由P-97微電極拉制儀（美國Sutter公司）拉制，尖端充以3 mol/L KCl，電極尖端電阻：10～40 MΩ）推進至心肌細胞表面，再改用步進式微電極推進器（MO-81，日本Narishiger科學儀器公司）以每步1 μm的步速將微電極刺入細胞。一旦刺入細胞，膜電位會突然下降，同時記錄到生物電信號。生物電信號經過Intra 767型微電極放大器（日本Narishiger科學儀器公司）放大后，輸入計算機信號采集分析系統（Powerlab/4sp，澳大利亞ADInstruments公司）來記錄和分析竇房結及心房肌細胞生物電的變化［6］。

1.2.3 觀察指標 先記錄正常的細胞電活動，包括竇房結細胞動作電位的自發頻率（APF）、閾電位（TP）、最大復極化電位（MDP）、靜息膜電位（RP）、動作電位幅度（APA）、0期去極化速度（Vmax 0）、4期自動去極化速度（Vmax 4）以及心房肌細胞的APF、RP、APA、Vmax 0和動作電位時程（APD50、APD90）。然后予以天麻素（2×10－5mol/L）［7］持續灌流10 min后，觀察竇房結和心房肌細胞的上述生物電指標的變化；沖洗后，再繼續記錄生物電信號并觀察上述指標的變化。通過竇房結細胞的生物電變化觀察天麻素對自律細胞的影響；通過心房肌細胞的生物電變化觀察天麻素對工作細胞的影響。

1.3 統計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，實驗數據以±s表示，藥物干預前后的比較采用配對樣本t檢驗。

2 結果

2.1 正常大鼠竇房結細胞生物電活動將玻璃微電極推進至上腔靜脈與右心房交界處，并把微電極的探頭電位調至零電位水平，通過步進式微電極推進器將微電極逐步刺入細胞，一旦入胞內即可引出竇房結細胞動作電位。見圖1中的Pre-Gastrodin。實驗中所記錄到的竇房結細胞生物電活動的各指標為APF：（256.64±32.97）bpm；TP：（－46.49± 7.32）mV；MDP：（－54.09±2.14）mV；APA：（52.34±11.14）mV；Vmax 0：（2 008.25± 1 056.77）mV/s；Vmax 4：（99.27±37.36）mV/s，n＝113個竇房結細胞。

2.2 正常大鼠心房肌細胞生物電活動將玻璃微電極推進至心房肌表面，以上述同樣方法引出心房肌細胞動作電位。如圖2中的Pre-Gastrodin。實驗中所記錄到的心房肌細胞生物電活動的各指標為APF：（241.35±39.68）bpm；RP：（－67.60±7.77）mV；APA：（74.68±8.90）mV；Vmax：（17 349.41± 3 740.14）mV/s；APD50：（0.172±0.006 8）s；APD90：（0.547±0.016 4）s，n＝291個心房肌細胞。

2.3 天麻素對竇房結細胞生物電活動的影響找到竇房結細胞后穩定5 min，記錄竇房結細胞正常電活動，然后予以天麻素（2×10－5mol/L）持續灌流10 min后，觀察并記錄竇房結細胞生物電的變化，沖洗后再記錄相應指標（實驗結果在同一細胞上獲得）。與天麻素灌流前比較，天麻素灌流后，大鼠竇房結細胞AP發放頻率明顯加快（t＝－8.371），心動周期縮短，Vmax 4明顯加快（t＝－6.161），差異均有統計學意義（P＜0.05），沖洗后上述參數均恢復，APA、Vmax 0及其余參數變化不明顯，結果表明天麻素可以提高竇房結細胞的自律性，見圖1、表1。

圖1 天麻素對竇房結細胞生物電活動的影響

表1 天麻素對大鼠竇房結細胞AP各參數的影響（±s）

表1 天麻素對大鼠竇房結細胞AP各參數的影響（±s）

與灌流前比較：*P＜0.05

項目APF（bpm）TP（mV）MDP（mV）APA（mV）Vmax 0（mV/s）Vmax 4（mV/s）灌流前251.99±29.99－47.08±7.30－54.09±8.8156.28±10.702 281.20±1 160.1494.76±30.67灌流后264.41±30.55*－45.31±8.05－53.82±7.8155.45±11.542 419.34±1 187.99125.02±31.05*洗脫252.66±30.19－45.47±8.35－52.86±8.6055.04±11.142 240.61±1 103.2490.85±22.83

表2 天麻素對大鼠心房肌細胞AP各參數的影響（±s）

表2 天麻素對大鼠心房肌細胞AP各參數的影響（±s）

與灌流前比較：*P＜0.05

項目APF（bpm）RP（mV）APA（mV）Vmax 0（mV/s）APD50（s）APD90（s）灌流前258.87±47.96－67.89±6.9877.81±7.0019 451.79±1 751.190.184±0.010.588±0.02灌流后273.21±41.49*－66.67±8.2377.96±5.5918 508.33±2 332.690.176±0.010.543±0.02*洗脫262.40±49.04－64.93±7.7676.96±6.2119 239.58±1 551.300.173±0.010.544±0.01

2.4 天麻素對心房肌細胞生物電活動的影響記錄心房肌細胞生物電活動，觀察用天麻素灌流前，灌流后及沖洗后的生物電變化，（實驗結果在同一細胞上獲得）。與天麻素灌流前比較，天麻素灌流后，APF加快（t＝－4.101），心房肌細胞APD90明顯縮短（t＝2.916），差異均有統計學意義（P＜0.05），沖洗后上述參數均恢復，APD50及其余參數變化不明顯，結果提示天麻素能縮短心房肌細胞動作電位時程，尤其是APD90，這可能與天麻素促進心房肌細胞3期K＋外流有關，見圖2、表2。

圖2 天麻素對心房肌細胞生物電活動的影響

3 討論

心律失常多由于心肌細胞膜離子活動的異?；顒铀?，本課題組前期研究［5］表明天麻素預處理可以減少在體大鼠心肌缺血再灌注損傷時心律失常的發生，加快大鼠心率，因此考慮天麻素可能會對心肌細胞膜離子通道活動有影響并能影響竇房結細胞的自律性。那么天麻素是否能直接影響心肌細胞生物電活動，國內外尚無這方面的報道，因此本課題組應用細胞內生物電記錄技術，在現有的實驗條件下，客觀真實地記錄到了竇房結細胞和心房肌細胞電活動，包括APF、RP、APA、Vmax和APD等，并通過灌流天麻素了解到天麻素對離體心肌細胞生物電活動的影響。離體細胞的記錄可以排除神經及體液因素對心肌細胞活動的影響，使對其離子機制的分析更加簡單直接。

本研究表明天麻素可以明顯加快離體竇房結細胞4期自動去極化速度，從而提高竇房結細胞的自律性，這與在體實驗下天麻素使大鼠心率加快的結果是一致的。

竇房結自律性的高低主要與4期自動去極化速度、MDA水平有關，竇房結4期自動去極化的離子機制包括外向電流的減弱和內向電流的增強［8］，其中IK是竇房結4期自動去極化的最重要的離子基礎，其次If離子流和T-Ca2＋通道開放引起的Ca2＋內流也是4期自動去極化必不可少的離子基礎。而實驗所測的天麻素對大鼠竇房結MDP無影響，因此初步認為天麻素抑制竇房結細胞K＋外流的可能性不大，若要明確需進一步通過膜片鉗技術來證明；If離子流是一種超極化激活的內向離子流［9］，If通道的最大激活電位為－100 mV左右，而實驗所測的大鼠竇房結MDP在－50 mV左右，因此考慮If在大鼠4期自動去極化過程中所起的作用不大；ICa-T參與起搏的機制是通過觸發肌漿網鈣釋放從而增加鈉鈣交換電流，由此產生的內向電流驅使細胞膜進一步去極至閾電位水平［10］。當4期自動去極化至－50 mV時，ICa-T被激活，綜合以上考慮天麻素增加竇房結4期自動去極化速度可能與增強T-Ca2＋通道通透性有關，這一假設還將通過應用T-Ca2＋通道拮抗劑Miberfradi來進一步研究。研究同時發現天麻素對竇房結細胞0期去極化速度及APA影響不大，推測天麻素可能不影響L-Ca2＋通道。

本研究顯示天麻素可以從而對抗心肌缺血引起的心肌細胞動作電位時程的延長，對心肌細胞起到保護作用。另外，天麻素對心房肌細胞0期去極化速度及APA的影響不大，提示天麻素對電壓門控式Na＋通道無影響，但是天麻素可以明顯縮短心房肌細胞動作電位時程，尤其是APD90，但不影響APD50，該結果提示天麻素能加快心房肌細胞3期K＋的外流，這可能與促進KATP的開放有關，從而對抗心肌缺血時APD的延長［11］，對心肌細胞起到保護作用。這點也與本課題組的在體研究［5］結果相一致。至于是否促進KATP的開放還需在后期的研究中通過應用KATP拮抗劑來進一步證實。

綜上所述，本實驗室在現有條件下記錄離體心肌細胞生物電活動的技術已相對成熟。在此基礎上研究天麻素對離體心肌細胞的作用，發現天麻素能加快竇房結細胞4期自動去極化速度，并縮短心房肌細胞動作電位時程，這可能與天麻素增強T-Ca2＋通道通透性，促進KATP的開放有關。

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Changes of electrophysiological profiles of rat myocardial cells after perfusing with Gastrodin

Wang Fei，Wei Kai，Shen Bing，et al
（Dept of Physiology，School of Basic Medical Science of Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo record the myocardial cell bioelectric activities and explore electrophysiological profiles of Gastrodin on rat myocardial cells.MethodsSinoatrial node cells and atrial myocytes isolated from 50 SD rats were used in this study to characterize the effect of Gastrodin on their electrophysiological profiles with intracellular recording approaches.ResultsIn the present experimental conditions，the bioelectric activities of sinoatrial node and atrial myocytes were truly recorded and we found that Gastrodin significantly accelerated AP frequency and Vmax 4 of sinoatrial node cells and shortened APD90of atrial myocytes.ConclusionThe experimental conditions of recording the bioelectric activities of myocardial cells in vitro are relatively mature.Gastrodin can affect the electrical activity of myocardial cells in vitro and the effects of Gastrodin may be related to inhance the permeability of T-Ca2＋channels and promote the opening of KATP.

Gastrodin；atrial myocytes；sinoatrial node cells；action potential

R 33-33；R 932

A

1000－1492（2014）03－0287－04

2013－08－26接收

安徽省教育廳科研課題（編號：2006KJ362b）；校級優秀青年教師后備人選基金資助（編號：2009A028）

安徽醫科大學基礎醫學院生理學教研室，合肥 230032

王 飛，女，碩士研究生；胡金蘭，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：hjlan1872＠163.com