青春期暴露氰戊菊酯對小鼠海馬雄激素受體和雌激素受體的影響

趙瑩瑩，代 波，王 華，張 程，徐德祥，孟秀紅

◇預防醫學研究◇

青春期暴露氰戊菊酯對小鼠海馬雄激素受體和雌激素受體的影響

趙瑩瑩1，代 波1，王 華2，張 程2，徐德祥2，孟秀紅1

目的探討青春期小鼠暴露氰戊菊酯（Fen）對其大腦海馬的雄激素受體（AR）和雌激素受體α（ERα）、雌激素受體β（ERβ）蛋白表達水平的影響。方法選取60只3周齡ICR小鼠，隨機均分為空白組、溶劑對照組、Fen（0.02、0.2、2 mg/kg）處理組，每組雌雄各半，在出生后28～56 d里，Fen處理組給予相應量的Fen，溶劑對照組給予等容積的玉米油，空白組不予任何處理。灌胃4周后處死小鼠，取其大腦海馬組織，采用Western blot法測定海馬AR、ERα和ERβ的表達水平。結果①青春期暴露Fen引起雄鼠海馬AR表達明顯升高，雌鼠海馬AR表達未發生顯著性改變；②青春期暴露Fen雄鼠海馬ERα和ERβ表達組間差異無統計學意義，雌鼠海馬ERα和ERβ表達亦無顯著變化。結論青春期暴露Fen干擾雄性小鼠海馬AR的表達。

青春期；海馬；雄激素受體；雌激素受體

氰戊菊酯（fenvalerate，Fen）屬于Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑，近些年由于其高效、光譜、低殘留等特點而廣泛用于工農業生產中。有研究［1］證明，青春期暴露Fen可干擾小鼠大腦皮層睪酮（testosterone，T）和雌二醇（estradiol，E2）合成。大腦皮層和海馬均可合成T和E2的各種關鍵酶，這些酶在維持大腦性分化和神經行為發育的過程中起重要的作用［2］。有研究［3］顯示，成年期大鼠的循環雄激素和雌激素水平至少有一部分是通過雄激素受體（androgen receptor，AR）來調節。該研究通過檢測青春期小鼠暴露Fen對海馬AR、雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）和雌激素受體β（estrogen receptor β，ERβ）的影響，旨在闡明Fen對小鼠海馬的內分泌干擾作用及其分子機制，為深入探討其他環境內分泌干擾物的作用機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物60只3周齡SPF級ICR小鼠，雌雄各半，購于安徽省醫學實驗動物中心，適應性喂養1周。雌雄鼠分籠飼養，飼養環境為晝夜12h交替，室內溫度維持在20～25℃，濕度控制在50%～60%。

1.2 主要試劑Fen、其他生化試劑均購自美國Sigma公司；AR、ERα和ERβ一抗抗體購自美國Santa Cruz或美國Upstate公司。

1.3 實驗動物處理60只ICR小鼠隨機均分為空白組、溶劑對照組、Fen（0.02、0.2、2 mg/kg）處理組，每組雌雄各半，在出生后28～56 d里，Fen（0.02、0.2、2 mg/kg）處理組按小鼠體重1%通過灌胃給予Fen，溶劑對照組給予等體積的玉米油，空白組不予處理。在56 d時處死小鼠，取其大腦海馬組織置于－80℃。采用Western blot法測定海馬中AR、ERα、ERβ蛋白表達水平。

1.4 Western blot法分析大腦海馬用RIPA裂解液提取總蛋白，兩次15 000 r/min離心15 min，Lowry法測總蛋白含量，對樣本進行蛋白定量后用98℃10 min進行蛋白變性。以蛋白含量100 μg/孔的樣品經過15%聚丙烯酰胺凝膠電泳3.5h后再以平行電泳方式轉移到活化后的PVDF膜上。置于5%脫脂牛奶中4℃封閉過夜。次日用1∶1 000的小鼠抗兔的多克隆抗體AR、ERα、ERβ和兔抗小鼠的βactin室溫孵育2～3h，用DPBST溶液洗滌4次，每次10 min，再用DPBS洗滌10 min。洗滌后的PVDF膜用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體（1∶40 000～80 000）孵育1～2h，再用DPBST洗膜。最后用增強化學發光ECL試劑盒進行檢測，用X線片顯影，以β-actin作為內參。

1.5 統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件分析，數據以±s表示，計量資料用方差分析。

2 結果

2.1 青春期小鼠體重小鼠生長發育狀況良好，毛色正常，平均飲水量和飼料攝入量差異無統計學意義。青春期階段均無疾病、感染和死亡現象，Fen（0.02、0.2、2 mg/kg）處理組小鼠體重與溶劑對照組體重相比差異無統計學意義，見表1。

表1 青春期Fen暴露對小鼠體重的影響（n＝6，g，±s）

表1 青春期Fen暴露對小鼠體重的影響（n＝6，g，±s）

注：PND為出生后天數

組別PND28PND35PND42PND49PND56空白（雄性）23.2±1.126.8±2.928.9±3.330.7±3.931.4±3.5溶劑對照（雄性）24.1±1.628.8±3.029.3±1.830.8±2.131.8±2.0氰戊菊酯（雄性，mg/kg）0.0223.1±1.127.1±1.927.9±1.829.9±2.030.1±1.6 0.223.2±2.328.2±3.029.8±3.031.4±3.032.0±3.2 2 23.5±2.027.8±3.229.7±3.131.2±3.330.1±3.2空白（雌性）22.2±2.524.8±3.225.3±2.027.3±2.628.9±2.5溶劑對照（雌性）22.3±1.326.1±2.326.1±2.128.0±1.729.1±1.9氰戊菊酯（雌性，mg/kg）0.0221.3±1.125.1±1.325.9±1.327.1±1.127.7±1.3 0.221.7±1.326.3±1.526.9±1.728.5±1.929.5±2.7 2 21.1±0.824.4±1.125.3±1.226.8±1.127.6±1.6

2.2 小鼠大腦海馬AR蛋白表達青春期暴露Fen（0.02、0.2、2 mg/kg）4周，雄性Fen（0.2、2 mg/kg）處理組AR蛋白表達均出現明顯上調，與溶劑對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；而雌性Fen（0.02、0.2、2 mg/kg）處理組和雄性Fen（0.02 mg/kg）處理組與溶劑對照組比較，差異無統計學意義，見圖1。

2.3 小鼠大腦海馬ERα蛋白表達青春期暴露Fen（0.02、0.2、2 mg/kg）4周，雄性Fen（0.02、0.2、2 mg/kg）處理組和雌性Fen（0.02、0.2、2 mg/kg）處理組ERα蛋白表達與溶劑對照組比較，差異均無統計學意義，見圖2。

2.4 小鼠大腦海馬ERβ蛋白表達青春期暴露Fen（0.02、0.2、2 mg/kg）4周，青春期各處理組雄性小鼠和雌性小鼠ERβ蛋白表達與溶劑對照組比較，差異均無統計學意義，見圖3。

3 討論

圖1 青春期暴露Fen對小鼠大腦海馬AR的影響

圖2 青春期暴露Fen對小鼠大腦海馬ERα的影響

Fen是一種潛在的環境內分泌干擾物。該研究探討了青春期接觸Fen對小鼠海馬的內分泌干擾作用。體外實驗［4］表明Fen具有微弱的擬雌激素活性。有研究［5］表明，孕期母鼠暴露于Fen，其子代雄性小鼠血清和睪丸中的T水平明顯下降。另外有研究［6］顯示，青春期及成年早期小鼠暴露Fen 60 mg/kg明顯降低血清和睪丸中T含量。另有研究［7］表明，青春期暴露Fen影響小鼠大腦皮層T和E2水平，并上調大腦皮層AR的蛋白表達水平。Du et al［8］利用熒光素酶報告基因的方法得出Fen是AR的拮抗劑，能抑制AR和雄激素結合，并且可以通過AR、ER干擾內分泌系統。

圖3 青春期暴露Fen對小鼠大腦海馬ERβ的影響

該研究探討了青春期暴露Fen對小鼠海馬AR、ERα和ERβ蛋白表達的影響。有研究［7］顯示，青春期暴露高劑量Fen（7.5、30 mg/kg）2周和4周顯示雌性小鼠大腦皮層AR蛋白表達均明顯上調，而青春期暴露Fen 4周后，雄鼠大腦皮層AR（7.5、30 mg/kg）和ERβ 30 mg/kg蛋白表達明顯上調。該實驗青春期低劑量暴露Fen（0.2、2 mg/kg）4周上調雄性小鼠海馬的AR蛋白表達水平，但雌性小鼠AR及雄鼠和雌鼠的ERα、ERβ蛋白表達水平變化差異無統計學意義。

有研究［9－10］顯示，大腦皮層和海馬合成的T通過神經元表達的AR和ERα、ERβ維持雄（男）性神經行為的正常發育，大腦皮層和海馬神經元AR的選擇性失活則損害雄性小鼠神經行為發育。另有研究［11］顯示，大腦皮層和海馬神經元CYP19和ERα選擇性失活損害攻擊性行為，提示雌激素和ERs在神經行為發育過程也起重要作用。其他的環境內分泌干擾物，比如雙酚A（bisphenol A，BPA），在腦發育關鍵期接觸低劑量BPA干擾大腦皮層和海馬甾體激素合成，并導致探索和情緒行為發育障礙［12］。

［1］ 劉 萍，孟秀紅，王 華，等.青春期氰戊菊酯暴露對小鼠大腦皮層性激素的影響［J］.安徽醫科大學學報，2011，46（7）：627－30.

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［12］Gioiosa L，Fissore E，Ghirardelli G，et al.Developmental exposure to low-dose estrogenic endocrine disruptors alters sex differences in exploration and emotional responses in mice［J］.Horm Behav，2007，52（3）：307－16.

Effects of pubertal fenvalerate exposure on androgen receptor and estrogen receptors inhippocampus of mice

Zhao Yingying1，Dai Bo1，Wang Hua2，et al
（1Dept of Maternal，Child＆Adolescent Health，2Dept of Toxicology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effects of pubertal fenvalerate exposure on the expression of androgen receptor（AR）and estrogen receptors（ERs）inhippocampus.Methods60 male and female mice in postnatal day（PND）28 were randomly divided into five groups：the blank group，the control group and fenvalerate（0.02，0.2，2 mg/kg）group.Pubertal male and female mice in treatment groups were treated with fenvalerate（0.02，0.2，2 mg/kg）by gavage daily from PND28 to PND56，while the blank gave nothing and controls received corn oil.After four weeks，the mice were sacrificed，thenhippocampus was excised.Protein expression of AR，two estrogen receptors（ERα and ERβ）inhippocampus were analyzed by Western blot.ResultsIn males，the protein expression of AR inhippocampus was markedly upregulated in pubertal fenvalerate exposure.In females，the protein expression of AR inhippocampus was of no statistically significant differences between groups.There was no statistically significant difference of the ERα and ERβ protein expression among all the sexual groups.ConclusionPubertal fenvalerate exposure disrupts AR expression inhippocampus of mice.

puberty；hippocampus；androgen receptor；estrogen receptors

R 977.12；R 179；R 322.811

A

1000－1492（2014）04－0464－04

2013－10－10接收

安徽省自然科學基金（編號：11040606M185）；國家自然科學基金（編號：81102155、81172711）

安徽醫科大學公共衛生學院1兒少與婦幼保健學系、2毒理學系，合肥 230032

趙瑩瑩，女，碩士研究生；孟秀紅，女，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：mengxiuhong＠163.com