三氯乙烯對小鼠肝臟PPARα和PPARγ表達的影響

侯菲菲，沈 彤，王 進，房 魏，張 澄，朱啟星

三氯乙烯對小鼠肝臟PPARα和PPARγ表達的影響

侯菲菲1，沈 彤1，王 進1，房 魏1，張 澄2，朱啟星2

目的探討飲水攝入三氯乙烯（TCE）對小鼠肝臟過氧化物酶體增殖物活化受體（PPAR）α和PPARγ的影響。方法雌性BALB/c小鼠隨機分為空白對照組、溶劑對照組、2.5 g/L TCE組和5.0 g/L TCE組，TCE經飲水暴露。分別在第2、4、8、12周時，取外周血檢測肝功能；處死小鼠取肝臟組織，HE染色進行病理觀察；分別采用實時熒光定量RTPCR法和免疫組化法檢測PPARα和PPARγ的mRNA水平和蛋白表達。結果與空白對照組及溶劑對照組比較，2.5、5.0 g/L TCE組小鼠谷丙轉氨酶（ALT）水平在第2、4周明顯升高（P＜0.05）；HE染色顯示2.5、5.0 g/L TCE組小鼠肝臟組織有明顯炎細胞浸潤及肝細胞變性，肝損傷在4周時最明顯；與空白對照組及溶劑對照組比較，2.5、5.0 g/L TCE組小鼠肝臟中PPARα和PPARγ mRNA表達量在4、8、12周時明顯上升（P＜0.05，P＜0.01）；2.5、5.0 g/L TCE組小鼠肝臟組織細胞核中均見PPARα和PPARγ的陽性表達，與空白對照組及溶劑對照組比較，各時期肝臟細胞核PPARα和PPARγ的陽性表達率顯著上升（P＜0.05）。結論飲水攝入TCE能上調小鼠肝臟PPARα和PPARγ表達。

三氯乙烯；PPARα；PPARγ；肝毒性

三氯乙烯（trichloroethylene，TCE）是工業上廣泛應用的氯代類有機溶劑，除職業暴露外，由于大量應用加之處置不當，其已大量進入大氣、土壤和地下水系統，成為一種重要的環境污染物［1］。職業環境中TCE暴露主要通過呼吸道和皮膚，而普通人群的TCE暴露主要是通過飲水攝入。TCE可引起機體多臟器損害，在TCE職業暴露人群中發生的TCE藥疹樣皮炎，患者在出現嚴重皮膚損害的同時還表現出明顯的肝臟損害［2］。研究［3］顯示長期TCE攝入主要引起肝臟毒性，目前TCE長期暴露引起肝臟毒性的具體機制還不清楚。研究［4］表明許多環境毒物所致肝臟毒性與其誘導核受體超家族轉錄因子過氧化物酶體增殖物活化受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）表達相關。該研究通過檢測經飲水攝入TCE小鼠肝臟損傷和肝臟中PPARα和PPARγ的表達情況，探討TCE暴露對小鼠肝臟PPARs表達的影響及其與肝臟毒性的關系，為防治TCE危害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器TCE和二甲基亞砜（DMSO）為分析純（美國Sigma公司）；RNA抽提試劑盒（美國QIAGEN公司）；反轉錄試劑盒和RT-PCR試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］；兔抗小鼠PPARα單克隆抗體和兔抗小鼠PPARγ單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；正常山羊血清封閉液（武漢博士德生物工程有限公司）；快捷性酶標羊抗兔IgG（福州邁新生物技術開發有限公司）；DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Applied Biosystems 7500實時PCR儀（美國AB公司）；Universal 320/320R型臺式低溫高速離心機（德國Hettich公司）；羅氏P800全自動生化儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 實驗動物及處理80只6周齡雌性BALB/c小鼠，SPF級，體重16～18 g，購自北京維通利華實驗動物中心，飼養于清潔動物房，維持12h光照/黑暗晝夜節律，自由進食；適應性飼養1周后隨機分為空白對照組、溶劑對照組、2.5 g/L TCE組和5.0 g/L TCE組。TCE用DMSO溶解（終濃度不超過1%）后經飲水攝入，每天記錄動物飲水量，為保持飲水中TCE濃度，每2 d換水1次；小鼠每周稱重1次；分別在第2、4、8、12周時摘眼球取血，處死小鼠無菌取肝臟，稱重，計算肝臟系數（肝臟重量/體重）。

1.3 肝功能檢測外周血4℃靜置1h后3 000 r/min離心10 min，取血清，全自動生化儀檢測肝功能指標谷丙轉氨酶（ALT）。

1.4 肝臟組織病理學檢查取新鮮肝臟組織固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋制備組織蠟塊，連續切片，常規HE染色，顯微鏡觀察組織病理學改變。

1.5 實時熒光定量RT-PCR法檢測肝臟PPARα和PPARγ mRNA水平取新鮮肝臟制備勻漿，用RNA抽提試劑盒提取總RNA，用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，按如下程序進行RT-PCR反應：94℃預變性5 min，35個循環，循環參數為94℃20 s，60℃20 s，72℃20 s，87℃10 s。以GAPDH為內參，用2－ΔΔCt法分析基因的相對表達量。引物序列為：PPARα：5′-GGGTACCACTACGGAGTTCACG-3′（上游），5′-CAGACAGGCACTTGTGAAAACG-3′（下游）；PPARγ：5′-TGACCACTCCCATTCCTTT-3′（上游），5′-GCTCTACTTTGATCGCACTTT-3′（下游）；GAPDH：5′-AGCAATGCCTCCTGCACCACCAAC-3′（上游），5′-CCGGAGGGGCCATCCACAGTCT-3′（下游）。

1.6 免疫組化法檢測肝臟PPARα和PPARγ蛋白表達取新鮮肝臟組織固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋制備組織蠟塊。切片后常規脫蠟水化，Triton X-100細胞通透，雙氧水消除內源性過氧化物酶，枸櫞酸鈉抗原修復，正常山羊血清封閉，滴加一抗（1∶500），4℃過夜，第2天取出洗凈后滴加二抗，PBS充分沖洗后DAB顯色，蘇木精復染，干燥，封片。陰性對照以等量PBS代替一抗，其他步驟同上。PPARα和PPARγ細胞核陽性表達率計算：400倍鏡下選取5個具有代表性的視野，計算陽性細胞所占百分比，并求其平均數。

1.7 統計學處理采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，數據以±s表示，符合正態分布的資料用單因素方差分析（ANOVA）進行多組間的比較，用t檢驗進行兩組間的比較，非正態分布資料采用非參數檢驗。

2 結果

2.1 一般情況實驗期間各組小鼠一般情況良好，未出現個體因TCE攝入而死亡，各組小鼠平均飲水量和體重增長差異無統計學意義，各時間點小鼠肝臟系數組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 飲水攝入TCE對小鼠肝功能的影響在2、4、8、12周，溶劑對照組小鼠肝臟ALT水平與空白對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；在2、4周，2.5、5.0 g/L TCE組ALT水平較對照組有所升高，并且5.0 g/L TCE組的升高趨勢比2.5 g/L TCE組更加明顯（P＜0.05，P＜0.01）；在8、12周，2.5、5.0 g/L TCE組ALT水平有所下降，但仍高于對照組，只有5.0 g/L TCE組ALT水平顯著高于對照組（P＜0.05，P＜0.01），其他組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

2.3 飲水攝入TCE對小鼠肝臟組織病理學影響組織病理檢查顯示，空白對照組和溶劑對照組小鼠肝細胞排列整齊，胞核大而圓，核仁明顯，胞質均勻，無炎性改變（圖2A、B）；TCE暴露組小鼠肝臟組織匯管周圍見明顯炎細胞浸潤，部分肝細胞輕度水腫，少許細胞變性或壞死，4周時最明顯（圖2F），且5.0 g/L組（圖2F）較2.5 g/L組（圖2E）顯著，在8周（圖2G、H）和12周時損傷程度有所減輕。

2.4 飲水攝入TCE對小鼠肝臟PPARα、PPARγmRNA水平的影響在2、4、8、12周，溶劑對照組小鼠肝臟PPARα和PPARγ mRNA水平與空白對照組比較差異無統計學意義；在4、8、12周，TCE暴露組PPARα mRNA水平高于空白對照組和溶劑對照組，且5.0 g/L TCE組上升趨勢高于2.5 g/L TCE組（P＜0.05，P＜0.01）；在4周時，2.5、5.0 g/L TCE組PPARγ mRNA水平均高于空白對照組和溶劑對照組（P＜0.05）；在8、12周，5.0 g/L TCE組PPARγ mRNA水平高于空白對照組和溶劑對照組（P＜0.05，P＜0.01），2.5 g/L TCE組PPARγ mRNA水平顯著高于空白對照組（P＜0.01），與溶劑對照組比較差異無統計學意義。在2周時，除5.0 g/L TCE組PPARγ mRNA水平高于空白對照組外（P＜0.05），其他組間比較差異均無統計學意義，見圖3。

2.5 飲水攝入TCE對小鼠肝臟PPARα、PPARγ蛋白表達影響免疫組化檢測顯示PPARα和PPARγ陽性表達細胞呈棕褐色，主要位于細胞核內，偶有胞質表達，陰性表達細胞呈淡藍紫色。空白對照組和溶劑對照組肝組織少見PPARα和PPARγ陽性表達，TCE暴露組小鼠肝臟組織各時期均顯示PPARα和PPARγ陽性表達，見圖4、5。統計顯示TCE暴露組肝組織胞核PPARα、PPARγ陽性表達率顯著高于空白對照組和溶劑對照組（P＜0.05），見表1。

圖1 飲水攝入TCE對小鼠ALT的影響（n＝5）

表1 肝臟PPARα、PPARγ細胞核陽性表達率（n＝3，±s）

表1 肝臟PPARα、PPARγ細胞核陽性表達率（n＝3，±s）

與空白對照組比較：*P＜0.05；與溶劑對照組比較：＃P＜0.05

項目組別2周4周8周12周PPARα空白對照0.020 0±0.001 80.023 8±0.003 80.019 4±0.003 50.025 0±0.006 1溶劑對照0.022 5±0.002 50.026 0±0.005 60.023 7±0.005 00.025 3±0.003 1 2.5 g/L TCE0.039 2±0.005 9*＃0.066 7±0.013 4*＃0.058 2±0.003 9*＃0.057 6±0.003 8*＃5.0 g/L TCE0.043 1±0.003 4*＃0.084 3±0.008 3*＃0.081 3±0.008 5*＃0.078 1±0.004 8*＃PPARγ空白對照0.017 9±0.001 60.017 5±0.001 80.018 6±0.000 30.017 9±0.001 3溶劑對照0.018 0±0.000 70.017 2±0.001 50.020 7±0.002 90.018 9±0.001 1 2.5 g/L TCE0.047 3±0.008 6*＃0.065 0±0.012 7*＃0.062 7±0.016 5*＃0.056 2±0.005 4*＃5.0 g/L TCE0.061 0±0.001 7*＃0.103 6±0.022 9*＃0.086 1±0.004 3*＃0.079 4±0.003 0*＃

圖3 TCE飲水暴露小鼠肝臟PPARα、PPARγ mRNA表達情況（n＝5）

圖4 小鼠肝臟組織PPARα表達 PV×400

圖5 小鼠肝臟組織PPARγ表達 PV×400

3 討論

研究［5］顯示長期暴露于TCE可致肝毒性，誘發肝臟炎癥、肝臟腫瘤等肝臟損傷，但具體機制目前仍不清楚。本研究在經飲水給予小鼠不同劑量［3］TCE后于不同時段進行肝功能檢測顯示，長期飲水攝入TCE可引起小鼠肝功能ALT上升，并在4周時達到最高，表明長期暴露于TCE可引起肝功能的損害；組織病理學檢查進一步顯示TCE染毒小鼠肝臟胞水腫變性、炎細胞浸潤等不同程度的肝損傷改變，而且也是4周時最為明顯。

研究［6－7］顯示TCE在肝臟細胞色素P450酶作用下生成的三氯乙酸（TCA）、二氯乙酸（DCA）具有過氧化物酶體增殖物（PP）的特性，從而激活PP的受體PPARs。激活的PPARs主要與靶基因啟動子區的PPAR反應元件（PPRE）的特定核苷酸序列結合，調節靶基因的轉錄；PPARs還可通過配體依賴的轉錄調控抑制核因子-κB（NF-κB）等表達調節炎癥細胞因子的表達［8］。PPARs有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ 3種亞型，Corton［9］認為PPARα在TCE誘發肝臟腫瘤中扮演著重要角色。本研究顯示，飲水給予TCE引起小鼠肝臟PPARα和PPARγ mRNA水平上調，與文獻［10］報道的TCE暴露引起PPARα mRNA表達量出現顯著增加一致；免疫組化檢測顯示TCE染毒動物肝臟細胞核PPARα和PPARγ的陽性表達較對照高，表明飲水攝入TCE后PPARα和PPARγ可能被激活；PPARα和PPARγ的表達在攝入TCE高劑量時較低劑量時明顯，且在TCE暴露4周時達最高與肝臟毒性的劑量和時間效應表現一致，由此推測，飲水攝入TCE導致的肝臟毒性可能與PPARα和PPARγ的激活有關。但本研究中并未觀察到染毒小鼠肝臟出現增殖腫大現象，肝臟系數變化也沒有明顯差異，這可能與樣本數量和小鼠的種屬與品系有關。本研究未對PPARα和PPARγ蛋白表達進行定量分析，因此不能對PPARα和PPARγ表達與TCE暴露所致肝損害進行相關性分析。

［1］ Agency for Toxic Substances and Disease Registry（ATSDR）.ToxFAQsTM for Trichloroethylene（TCE）［DB/OL］.http://www.atsdr.cdc.gov/toxfaqs/tf.asp？id＝172＆tid＝30.2003

［2］ Jollow D J，Bruckner J V，McMillan D C，et al.Trichloroethylene risk assessment：A review and commentary［J］.Crit Rev Toxicol，2009，39（9）：782－97.

［3］ Griffin J M，Gilbert K M，Lamps L W，et al.CD4（＋）T-cell activation and induction of autoimmunehepatitis following trichloroethylene treatment in MRL＋/＋mice［J］.Toxicol Sci，2000，57（2）：345－52.

［4］ Maloney E K，Waxman D J.Trans-activation of PPARα and PPARγ by structurally diverse environmental chemicals［J］.Toxicol Appl Pharmacol，1999，161（2）：209－18.

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［10］Ramdhan D H，Kamijima M，Wang D，et al.Differential response to trichloroethylene-inducedhepatosteatosisinwild-typeand PPARα-humanized mice［J］.Environ Health Perspect，2010，118（11）：1557－63.

Effects of trichloroethylene on the expression of liver PPARα and PPARγ in mice

Hou Feifei，Shen Tong，Wang Jin，et al
（Dept of Toxicology，School of Public Health，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effects of trichloroethylene（TCE）intake via drinking water on liver peroxisome proliferator activated receptor（PPAR）α and PPARγ in mice.MethodsThe female BALB/c mice were randomly divided into blank control group，vehicle control group，2.5 g/L TCE group and 5.0 g/L TCE group，and were exposed to TCE via drinking water.On the 2nd，4th，8th，12th week，blood was collected for liver function examination，liver tissues were taken for HE staining.The PPARα and PPARγ expression in liver were measured by RT-PCR and immunohistochemical staining.ResultsThe levels of ALT in 2.5，5.0 g/L TCE treated groups increased significantly compared with control groups on the 2nd，4th week（P＜0.05）；HE staining showed inflammatory cell infiltration and liver cell degeneration in 2.5，5.0 g/L TCE treated groups，the damage was most obvious on the 4th week；compared with control groups，PPARα and PPARγ mRNA expression in liver of TCE treated groups increased significantly on the 4th，8th，12th week（P＜0.05，P＜0.01）；in the nuclei of liver cells，the expression of PPARα and PPARγ was positive in 2.5，5.0 g/L TCE treated groups，and the levels of PPARα and PPARγ expression in nuclei increased significantly compared with control groups on the 2nd，4th，8th，12th week（P＜0.05）.ConclusionThe results suggest that TCE intake via drinking water can upregulate the expression of liver PPARα and PPARγ in mice.

trichloroethylene；PPARα；PPARγ；hepatotoxicity

R 114

A

1000－1492（2014）04－0467－05

2013－11－25接收

安徽省自然科學基金項目（編號：11040606M213）；教育部科學技術研究重點項目（編號：210100）

安徽醫科大學公共衛生學院1衛生毒理學系、2勞動衛生與環境衛生系，合肥 230032

侯菲菲，女，碩士研究生；沈 彤，男，博士，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：ahmusht＠163.com