CXCL16及CXCL10在狼瘡性腎炎患者中的表達及與疾病活動的相關性

夏 瓊，徐星銘

CXCL16及CXCL10在狼瘡性腎炎患者中的表達及與疾病活動的相關性

夏 瓊，徐星銘

目的探討趨化因子配體16（CXCL16）及趨化因子配體10（CXCL10）在狼瘡性腎炎（LN）患者血清、尿液以及腎臟內的表達以及與疾病活動的關系。方法ELISA法檢測LN患者及正常對照者血清、尿液中CXCL16、CXCL10的表達水平，免疫組化法檢測經腎臟活檢確診為LN的患者以及正常對照者腎臟組織中的CXCL16的表達水平。結果

狼瘡性腎炎；CXCL16；CXCL10

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統，以T、B淋巴細胞功能異常為主要特征的自身免疫性疾病，有著復雜的細胞及細胞因子的相互作用。趨化因子作為重要的細胞因子之一，在介導細胞間相互作用以及調節體內免疫平衡起著至關重要的作用。研究［1］表明，趨化因子配體10（CXCL10）可能參與SLE的發病過程，并與SLE活動度有關，通過與受體CXCR3結合誘導炎性細胞聚集到炎癥部位并釋放細胞因子。趨化因子配體16（CXCL16）作為CXC家族的新成員［2］，通過特異性與CXCR6結合從而募集T細胞、NKT細胞到達不同組織啟動多種急慢性炎癥。在狼瘡小鼠中可見血液以及尿液的CXCL16的表達有所增加，且與系統性紅斑狼瘡疾病活動指數（SLEDAI）評分有關［3］，但關于CXCL16在狼瘡性腎炎（LN）患者腎內的表達尚未見報道。該研究通過檢測CXCL10、CXCL16體內水平，揭示二者可能參與疾病發病機制，并為臨床評估提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年3月～2013年3月安徽醫科大學第一附屬醫院腎臟內科76例住院患者血清（其中43例患者同時留取尿液），其中男7例，女69例，年齡14～59（33.34±11.7）歲。所有患者均符合美國風濕病協會（ARA）修訂的SLE標準。收集14例門診健康體檢者（各項生化指標正常、自身抗體陰性、無糖尿病、高血壓等基礎疾病）的血清和尿液作為正常對照組，其中男2例，女12例，年齡18～35（26.35±5.24）歲。76例患者中有41例經腎臟活檢確診為LN（Ⅲ型7例，Ⅳ型26例，Ⅴ型8例）。選取10例泌尿外科腎腫瘤切除患者遠離腫瘤部位至少2 cm的腎臟組織作為正常腎臟組織對照。本實驗符合院倫理委員會要求，入選患者均知情并簽署同意書。

1.2 主要試劑CXCL16、CXCL10的ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技公司；兔抗人CXCL16單克隆抗體購自美國Abcam公司（ab101404）；正常山羊血清封閉液、PBS緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、二抗試劑盒（試劑B、C分別為生物素化通用二抗工作液，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液）、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料及相關指標的收集 記錄患者入院后所檢測的臨床指標，包括血尿常規、肝腎功能、免疫球蛋白＋補體、24h尿蛋白定量、腎臟活檢病理類型等，并計算患者的SLEDAI評分。LN患者及正常對照者清晨空腹常規肘靜脈采血3 ml置于含有枸櫞酸鈉抗凝劑的試管中，LN患者的尿液一般收集于首次入院后，正常對照者收集于門診的隨機尿，后均以2 500 r/min離心10 min，分離上清液置于－80℃冰箱留待測定。

1.3.2 ELISA法測定CXCL16、CXCL10水平 按照試劑盒說明書操作，分別測定血清及尿液中CXCL16、CXCL10水平。

1.3.3 免疫組化 石蠟切片（2 μm）脫蠟，水化，微波修復，H2O2孵育，封閉后加入一抗（1∶100），4℃冰箱內過夜，后B、C試劑孵育，DAB顯色，蘇木精復染，PBS返藍，脫水，封片。免疫組化圖片使用Image Pro-Plus 16.0圖像分析軟件處理，以高倍鏡下累計光密度（IOD）平均值代表該患者腎內CXCL16表達水平。

1.4 統計學處理采用SPSS 20.0統計軟件分析，數據以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗，指標相關性用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 血清中CXCL16、CXCL10的表達ELISA法檢測LN組血清CXCL16水平高于正常對照組（P＜0.05，F＝0.56，t＝2.44），CXCL10同樣升高（P＜0.05，F＝2.94，t＝3.97），見表1。Pearson線性相關分析提示二者血清中的表達水平呈正相關（r＝0.68，P＜0.01）。方差分析顯示Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型LN之間的血清CXCL16、CXCL10表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 LN患者與正常對照者血清CXCL16、CXCL10表達水平（μg/L，±s）

表1 LN患者與正常對照者血清CXCL16、CXCL10表達水平（μg/L，±s）

與正常對照組比較：*P＜0.05

組別n CXCL10CXCL16正常對照146.48±2.212.31±0.73 LN7610.59±3.72*2.99±0.98*Ⅲ型78.24±2.432.68±0.54Ⅳ型2611.17±3.26*3.12±1.01*Ⅴ型89.46±1.93*2.84±0.91*

2.2 尿液中CXCL16、CXCL10的表達ELISA法檢測LN組尿液中的CXCL16、CXCL10表達均高于正常對照組（P＜0.01，F＝1.26、2.43，t＝3.72、2.82），見表2。Pearson相關分析提示LN組CXCL10的尿液表達水平與其血清中的表達呈正相關（r＝0.40，P＜0.05），LN組尿液CXCL16表達水平與SLEDAI評分呈正相關（r＝0.34，P＜0.05），見圖1。Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型之間的尿液CXCL16、CXCL10表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 LN患者與正常對照者尿液CXCL16、CXCL10表達水平（μg/L，±s）

表2 LN患者與正常對照者尿液CXCL16、CXCL10表達水平（μg/L，±s）

與正常對照組比較：**P＜0.01，*P＜0.05

組別n CXCL10CXCL16正常對照146.81±0.902.51±0.37 LN438.07±1.52**3.12±0.56**Ⅲ型77.63±1.45*2.88±0.45*Ⅳ型268.16±1.59**3.20±0.76**Ⅴ型87.96±1.23**3.01±0.57**

圖1 尿液中CXCL10與血清CXCL10、尿液CXCL16水平與SLEDAI評分的散點圖

2.3 腎臟中CXCL16的表達在正常對照者的腎臟組織中可見CXCL16在腎小管上皮細胞有較強的表達，但在腎小球未見表達，LN組的腎臟組織可見腎小管上皮細胞CXCL16的表達增加，小球中亦可見到表達，見圖2。LN組IOD值較正常對照組表達增加（P＜0.05），方差分析提示Ⅳ型的IOD值較Ⅲ型、Ⅴ型LN患者差異有統計學意義（P＜0.05），但Ⅲ型、Ⅴ型之間差異無統計學意義，見表3。

2.4 CXCL16、CXCL10在血清中的表達與臨床指標相關性分析CXCL10的血清水平與SLEDAI評分呈正相關（r＝0.39，P＜0.01），與補體C3呈負相關（r＝－0.49，P＜0.01），與白細胞計數、血小板計數、血清IgG、IgA、IgM、補體C4以及24h尿蛋白等指標無相關性。CXCL16的血清水平與SLEDAI、補體C3、補體C4、白細胞計數、血小板計數、血清IgG、IgA、IgM以及24h尿蛋白等指標無相關性。

表3 LN患者與正常對照者腎內CXCL16水平（±s）

表3 LN患者與正常對照者腎內CXCL16水平（±s）

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圖2 正常腎臟組織以及LN患者腎內CXCL16的表達 SP×400

2.5 CXCL16、CXCL10在尿液中的表達與臨床指標相關性分析尿液中CXCL10的水平與SLEDAI評分、白細胞計數、血小板計數、血清IgG、IgA、IgM、補體C3、補體C4以及24h尿蛋白等指標無相關性，CXCL16的尿液水平與SLEDAI評分呈正相關（r＝0.34，P＜0.05），與其他指標無明顯相關性。

3 討論

CXCL16一般以膜結合型、分泌型兩種形式存在，具有主要功能的為分泌型。膜結合型的CXCL16在抗原遞呈細胞如單核細胞、巨噬細胞、B細胞、樹突狀細胞中表達。可溶性CXCL16由細胞膜上的金屬蛋白水解酶10裂解切割巨噬細胞和樹突狀細胞上的膜結合型CXCL16后分泌產生，在效應T細胞的遷移、細胞免疫應答和炎癥反應、新生血管以及動脈硬化中發揮十分重要的作用［4－5］。與以往報道類似［3，6］，本實驗顯示LN患者的血清以及尿液中的CXCL16水平均較正常對照者明顯上升，并且尿液中CXCL16水平與SLEDAI呈正相關。在MRL-lpr小鼠中，CXCL16 mRNA水平明顯增高［7］。這些均提示了CXCL16可能參與了SLE的免疫應答，且本研究顯示無論在正常對照組還是LN組尿液中的CXCL16水平均高于血清中的水平，提示CXCL16除了來源于血清還可能來源于腎臟，但其在疾病中的作用有待進一步研究。

在實驗性誘導抗腎小球基底膜抗體相關腎小球腎炎中［8］，CXCL16在腎小球內皮細胞表達，在腎小球急進性炎癥進展階段，阻斷CXCL16可以顯著減弱單核巨噬細胞的浸潤以及腎小球的損傷，蛋白尿也得到了緩解。在糖尿病腎病小鼠［9］中CXCL16更多地分布在腎小球中的足細胞。本實驗通過免疫組化證實了在正常對照組CXCL16較多表達于腎小管上皮細胞，腎小球很少表達［10］，但LN組患者中發現腎小管、小球的表達量較正常對照組均上升，尤其是腎小球的表達量明顯增加，Ⅳ型LN的表達量較Ⅲ型、Ⅴ型尤為升高，Ⅳ型為LN患者中病理程度最為嚴重的一種，提示CXCL16可能參與了LN的病理發展過程。

CXCL10是較早發現的一種趨化因子，之前研究較多。與之前的研究結果相似［1，11］，本實驗同樣驗證了LN組CXCL10水平較正常對照者明顯上升，并與SLEDAI呈正相關，與補體C3呈負相關。兒童LN患者［12］的血清中CXCL10同樣明顯上升，而且外周血中的CXCR3＋CD4＋T細胞則下降，可能與腎內組織高表達的CXCL10遷移了外周T細胞有關，但本實驗未行腎臟組織CXCL10的免疫組化，在后續的實驗中應涉及。

已有研究［13］表明在Ⅳ型LN患者的尿液沉渣細胞中CXCL10和受體CXCR3 mRNA水平較Ⅲ型、Ⅴ型有所上升，本研究中ELISA法同時檢測了尿液中的CXCL10的水平，發現LN組也高于正常對照組，并且尿液中的表達水平與血清中CXCL10的表達呈正相關，雖然尿液CXCL10的水平與SLEDAI無明顯相關性，但應考慮到在LN組患者中CXCL10的尿液水平小于血清，血清水平更能代表其體內的CXCL10水平，而CXCL16剛好相反，尿液水平表示其體內總體水平更為合適。聯合二者之間對于臨床判斷SLE活動程度有一定的意義，但由于現有LN的研究中關于CXCL16的報道較少，是否與CXCL10之間存在相互關系仍有待進一步驗證。

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Expression of CXCL16 and CXCL10 correlates with disease activity in lupus nephritis patients

Xia Qiong，Xu Xingming
（Dept of Nephrology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo discuss the expression of CXC Chemokine Ligand 16（CXCL16）and CXC Chemokine Ligand 10（CXCL10）in serum，urine and renal tissue in lupus nephritis（LN）.MethodsThe serum and urine levels of CXCL10，CXCL16 were assessed by ELISA in LN patients and normal controls.Immunohistochemistry was used to detect the renal tissue expressions of CXCL16 in patients andhealthy controls.ResultsThe serum and urine concentrations of CXCL10 and CXCL16 were significantlyhigher in LN patients than those inhealthy controls（P＜0.01）.In addition，the level of serum CXCL10 showed positive correlation with SLEDAI and negative correlation with serum C3 level（P＜0.01），the expression of urine CXCL16 showed positive correlation with SLEDAI（P＜0.05）.Inhealthy renal tissues CXCL16 was distributed mainly in renal tubules and rarely seen in glomerular cells while the expressions in renal tubules increased and glomeruli stainings were found in LN paitients.CXCL16 expressed significantly in LN patients than normal controls（P＜0.05）.Besides，different concentrations of CXCL16 were observed inⅢ，ⅣandⅤLN，the expressions of CXCL16 inⅣLN werehigher than those inⅢLN andⅤLN（P＜0.01），while no difference between theⅢLN andⅤLN.ConclusionCXCL10 and CXCL16 may play key roles in the pathogenesis of LN and both of CXCL10 in serum and CXCL16 in urine may be useful as markers of disease activity.The change of CXCL16 may associate with the pathology category of LN.

lupus nephritis；CXCL16；CXCL10

R 593.242

A

1000－1492（2014）04－0491－04

2013－11－25接收

國家自然科學基金（編號：30572356）

安徽醫科大學第一附屬醫院腎臟內科，合肥 230022

夏 瓊，女，碩士研究生；徐星銘，女，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：xxm2425＠163.com

LN患者血清以及尿液中的CXCL16、CXCL10與正常對照者比較均升高（P＜0.01），且血清中CXCL10水平與系統性紅斑狼瘡疾病活動指數（SLEDAI）評分呈正相關（r＝0.39，P＜0.01），與補體C3呈負相關（r＝－0.49，P＜0.01），尿液中CXCL16水平與SLEDAI評分呈正相關（r＝0.34，P＜0.05）。正常對照組腎臟的小管上皮細胞可見CXCL16較強的表達，腎小球很少表達，但在LN患者可見小管中表達有所增強，小球中明顯增強，其腎內的CXCL16的表達水平較正常對照組上升（P＜0.05），尤以Ⅳ型顯著（P＜0.05）。結論CXCL10、CXCL16可能參與LN的發病過程，血清CXCL10和尿液中CXCL16水平的檢測對于判斷疾病的臨床活動具有一定的意義，其中CXCL16可能與LN的病理變化有關。