潰瘍性結腸炎患者外周血中MMP-2、MMP-9與腸黏膜通透性關系的臨床研究

薛永舉，梅 俏，丁 浩，胡 靜，劉曉昌，許建明，胡乃中

潰瘍性結腸炎患者外周血中MMP-2、MMP-9與腸黏膜通透性關系的臨床研究

薛永舉1，2，梅 俏1，丁 浩1，胡 靜1，劉曉昌1，許建明1，胡乃中1

目的探討潰瘍性結腸炎（UC）患者中基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9水平與腸黏膜通透性的臨床關聯，為UC的發病機制及治療提供可靠的參考指標。方法采用ELISA法檢測38例UC患者（UC組）和30例正常對照者（正常對照組）外周血中MMP-2、MMP-9水平；采用高效液相色譜示差法檢測UC組和正常對照組口服乳果糖（L）和甘露醇（M）測試液后尿液中L、M含量，計算L/M比值。結果UC組外周血中MMP-2、MMP-9水平顯著高于正常對照組（P＜0.05）。UC組外周血中MMP-2、MMP-9水平與UC疾病嚴重程度及病變范圍呈一定相關性；UC組患者尿中L/M比值顯著高于正常對照組（P＜0.05），UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平與腸黏膜通透性改變有良好的相關性。結論活動期UC患者腸黏膜通透性增高，可能與外周血中MMP-2、MMP-9水平增高有關。

基質金屬蛋白酶-2；基質金屬蛋白酶-9；腸黏膜通透性；潰瘍性結腸炎

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種反復發作的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，近年有研究［1］顯示UC患者多存在不同程度的腸黏膜通透性增高的現象。且有研究［2］表明，腸黏膜通透性的改變可發生在腸道出現明顯的炎性改變之前。UC的主要病理損傷涉及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的更新及結締組織的重建。ECM是細胞附著的基本框架和代謝場所，其成分的降解與合成處于動態平衡狀態，如平衡紊亂將導致器官的各種病理改變，如潰瘍形成或器官纖維化［3－4］。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）裂解ECM成分，可通過降解內皮細胞間緊密連接引起血管內皮通透性增加，參與結腸黏膜損傷和并與結腸組織修復有關［5］。該研究通過檢測UC患者外周血中MMP-2及MMP-9水平，并與UC患者的腸黏膜通透性及主要臨床特征進行關聯分析，以期為UC的發病機制及治療提供可靠的參考指標。

1 材料與方法

1.1 研究對象選擇2010年7月～2012年9月在安徽醫科大學第一附屬醫院診斷為活動性UC患者38例（UC組），男20例，女18例，年齡21～70（34.7±10.3）歲，其診斷標準參考2007年《對我國炎癥性腸病診斷治療規范的共識意見》［6］，排除標準如下：①排除其他自身免疫性疾病；②排除感染性結腸炎：痢疾桿菌感染，沙門氏菌感染、阿米巴感染、血吸蟲感染及腸結核等；③排除克羅恩病、大腸癌、肝炎等；④排除真菌性腸炎、出血壞死性腸炎、過敏性紫癜、膠原性結腸炎、結腸憩室、HIV感染合并的結腸炎等。正常對照組30例，其中男16例，女14例，年齡24～59（37.6±8.9）歲。各組間在年齡、性別比較差異無統計學意義。

1.2 主要試劑人MMP-2、MMP-9酶聯免疫檢測試劑盒均購自美國R＆D公司；乳果糖及甘露醇標準品購自美國Sigma公司；乙腈（色譜純）：美國天地公司產品；乳果糖口服液：荷蘭蘇威公司；20%甘露醇溶液：安徽雙鶴藥業股份有限公司。

1.3 主要儀器酶標儀RS-232：瑞士公司；Agilentl100系列高效液相色譜儀系列配置G1362A示差檢測器（美國Agilent公司產品）；SB3200超聲波清洗器（上海必能信超生有限公司產品）；Agilent色譜數據工作站：美國Agilent公司軟件（2001-2008）。

1.4 方法

1.4.1 ELISA法檢測MMP-2、MMP-9水平 研究對象均于清晨空腹平靜狀態下抽取5 ml肘靜脈血，按試劑盒說明書采用雙抗體夾心ELISA法檢測血漿MMP-2、MMP-9的水平。

1.4.2 尿液標本收集 所有測試者前1 d晚上22時起禁食水，次日清晨空腹排空尿液后，口服L和M測試液各50 ml，此后禁水30 min、禁食2h，收集口服L和M后6h內全部尿液，取其中20 ml滴入2%硫柳汞2～4滴作防腐處理后，置－20℃保存待測［7］，后將冰凍貯存樣品常溫溶化、搖勻、離心10 min，以去除沉淀物后加入相應試劑后上機檢測。

1.4.3 尿液中L和M濃度測定方法 采用HPLC示差法檢測尿液中L和M濃度并進行方法學評價［7］。取所有研究對象1 ml尿液置于EP管中，予離心處理，離心時間10 min；吸取上清液，并加入100 ml乙腈沉淀蛋白，漩渦混合后再次離心、吸取上清液去離子處理后漩渦混合、離心、吸取上清液，最后使用水系濾膜過濾樣品，色譜條件：Hypersil NH2柱（4.6 mm×250.0 mm，5μm），柱溫設置為25℃，示差檢測器：內加熱32℃，進樣檢測乳果糖和甘露醇含量，乙腈、水（80∶20，V/V），流速1 ml/min［8］。

1.5 統計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料采用±s表示，經方差齊性檢驗后，采用Pearson等級相關檢驗行相關性分析。

2 結果

2.1 UC組臨床特征分析UC組患者中，按嚴重程度分類：輕度12例（32%），中度14例（36%），重度12例（32%）；按病變范圍分類：全結腸炎12例（32%），左半結腸炎8例（21%），直乙狀結腸炎9例（23%），直腸炎9例（24%）。

2.2 兩組外周血MMP-2、MMP-9水平比較UC組外周血中MMP-2為（8.34±2.54）pg/L，MMP-9為（8.56±2.45）pg/L，正常對照組MMP-2為（1.91 ±0.30）pg/L，MMP-9為（2.14±0.31）pg/L，UC組MMP-2水平和MMP-9水平高于正常對照組（t＝2.414，P＜0.05；t＝2.576，P＜0.05）。

2.3 UC患者外周血MMP-2、MMP-9水平與主要臨床特征的關聯分析UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平與病變程度和病變范圍均呈一定程度相關，差異有統計學意義（r＝0.692，P＜0.05；r＝0.661，P＜0.05），見表1。

2.4 兩組L/M比值測定UC組的L和M排出的比值（0.057±0.020）與正常對照組的L和M排出比值（0.030±0.005）相比顯著升高（P＜0.05），表明UC患者腸黏膜通透性明顯增高。

2.5 UC患者的L/M測定與主要臨床特征的關聯分析UC患者L/M水平與病變程度和病變范圍均呈一定程度相關，差異有統計學意義（r＝0.794，P＜0.05；r＝0.728，P＜0.05），見表2。

2.6 UC組患者外周血MMP-2、MMP-9水平與L/M比值關聯分析UC組患者外周血MMP-2、MMP-9水平與其L/M比值呈一定程度相關，差異有統計學意義（r＝0.844，P＜0.05；r＝0.861，P＜0.05）。

表1 UC組患者血MMP-2、MMP-9水平與臨床特征分析（±s）

表1 UC組患者血MMP-2、MMP-9水平與臨床特征分析（±s）

臨床特征nMMP-2（pg/L）P值F值MMP-9（pg/L）P值F值嚴重程度0.005147.90.007 199.49輕度124.07±0.705.39±0.51中度146.12±0.438.25±0.54重度1210.66±1.511.47±1.08病變范圍0.013 226.280.019 208.35全結腸炎1212.37±1.1213.11±1.07左半結腸炎89.56±0.549.41±0.53直乙狀結腸炎96.31±0.617.28±0.28直腸炎94.14±0.415.51±0.64

表2 活動期UC患者L/M比值與臨床特征分析（±s）

表2 活動期UC患者L/M比值與臨床特征分析（±s）

臨床特征nL/M比值P值嚴重程度＜0.05輕度120.032±0.008中度140.049±0.011重度120.067±0.014病變范圍＜0.05全結腸炎120.070±0.009左半結腸炎80.062±0.006直乙狀結腸炎90.043±0.009直腸炎90.031±0.005

3 討論

MMPs是降解ECM成分的蛋白水解酶，MMPs的活性增加可能會導致結腸的上皮損傷，在與炎癥有關的組織破壞和重構中發揮了重要作用［9］。近年來有研究［10］顯示，MMPs在UC的病理生理過程中發揮重要作用。MMP-2和MMP-9在UC中主要降解Ⅳ型膠原，Ⅳ型膠原是基底膜主要成分，作為屏障起到阻止炎癥擴散作用［11］。Garg et al［12］發現在炎癥性腸病（IBD）中MMP-9通過調節杯狀細胞減弱黏膜防御引起結腸炎癥。Meijer et al［13］檢測122例克隆恩病（Crohn＇s disease，CD）患者、20例UC患者及62例正常人回結腸標本MMPs及TIMPs水平，發現MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9及TIMP-1、TIMP-2水平在CD和UC患者中均有明顯增高，且MMPs水平與結腸中髓過氧化物酶水平呈正相關。國內研究［14］表明，MMP-2在UC患者病變組織中呈高表達。Von Lampe et al［15］檢測21例UC患者和21例CD患者結腸活檢標本中MMPs及TIMPs mRNAs表達，發現UC和CD中MMP-2、MMP-1、MMP-4及TIMP-1 mRNAs表達顯著增加，表明MMPs在IBD的結腸組織破壞和重構中發揮重要作用。

本研究結果表明UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平明顯高于正常對照組，提示MMP-2、MMP-9可能參與UC的病理生理機制。通過UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平與UC主要臨床特征的關聯分析，發現重度活動期UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平明顯高于中度患者，同時不同病變范圍的活動期IBD患者間MMP-2、MMP-9水平存在一定差別，表明活動期UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平與疾病嚴重程度、病變范圍呈相關性。同時，外周血中MMP-2、MMP-9水平與腸黏膜通透性有良好相關性。

綜上所述，活動期UC患者外周血中MMP-2、MMP-9水平明顯增高，與UC嚴重程度和病變范圍呈一定相關，提示MMP-2、MMP-9可能是腸黏膜通透性改變的關鍵分子，但參與UC發病及腸黏膜通透性改變還有很多其他重要的因素，有待于進一步研究。

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The relationship between the expression of matrix metalloproteinases and intestinal mucosal permeability in patients with ulcerative colitis

Xue Yongju1，2，Mei Qiao1，Ding Hao，et al
（1Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，The Key Laboratory for Digestive Diseases of Anhui Province，Hefei 230022；2Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233003）

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of matrix metalloproteinases（MMPs）and intestinal mucosal permeability in patients with ulcerative colitis.Methods38 UC patients and 30healthy controls were enrolled in this study，the levels of MMP-2 and MMP-9 in the serum were assessed by ELISA method.Detected the lactulose and mannitol in urine of 38 UC patients and 30healthy people after they took orally the lactulose and mannitol test solution by HPLC-RI method and calculated the ratio of them.ResultsThe serum levels of MMP-2 and MMP-9 in UC patients were significantlyhigher than that inhealthy controls，which were correlated with the severity and extent of disease（P＜0.05）.The lactulose/mannitol ratio in 38 UC patients was signifi-cantlyhigher than that in 30 control people.The serum levels of MMP-2 and MMP-9 in UC patients were correlated with the the change of intestinal mucosal permeability.ConclusionThe serum levels of MMP-2 and MMP-9 in UC patients are significantly increased，which is correlated with the change of intestinal mucosal permeability.

MMP-2；MMP-9；ulcerative colitis；intestinal mucosal permeability

R 574.1

A

1000－1492（2014）04－0495－04

2013－11－25接收

安徽省自然科學基金（編號：09020103010）

1安徽醫科大學第一附屬醫院消化內科，安徽省消化病重點實驗室，合肥 230001

2蚌埠醫學院第一附屬醫院消化內科，蚌埠 233003

薛永舉，男，主治醫師；梅 俏，男，博士，副教授，副主任醫師，責任作者，E-mail：meiqiao＠hotmail.com