Livin與Caspase-3在口腔鱗狀細胞癌中的表達及相關性研究

解傳斌，顏雨春

Livin與Caspase-3在口腔鱗狀細胞癌中的表達及相關性研究

解傳斌，顏雨春

目的探討凋亡抑制蛋白（IAP）Livin和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）在口腔鱗狀細胞癌（OSCC）中的表達及其相關性，為對患者診斷及監測、評估術后復發、轉移的風險程度提供參考。方法采用RT-PCR法對45例OSCC組織及11例正常口腔組織（NOT）中的Livin mRNA與Caspase-3 mRNA的表達進行檢測。結果Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在45例OSCC組織及11例NOT組織均有不同程度的表達；Livin mRNA在OSCC組織中的表達高于NOT組織（P＜0.05），在有淋巴結轉移組的表達高于無淋巴結轉移組，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩者在OSCC組織中的相對含量均與患者的性別和年齡無關，但與腫瘤的病理分期、分化程度有關，相關分析顯示Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC組織中的表達呈相關關系，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論Livin與Caspase-3基因的異常表達與OSCC的病理生物學行為密切相關，聯合檢測Livin與Caspase-3可為評價OSCC的浸潤、轉移及患者預后提供臨床參考，為研究OSCC發病機制提供新的思路。

口腔鱗狀細胞癌；凋亡抑制蛋白Livin；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；RT-PCR

在頭頸部惡性腫瘤中，口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）較常見，因其惡性程度較高，且具有較強的浸潤性，易發生淋巴結及遠處臟器轉移，嚴重危害患者的生命安全。我國口腔頜面部的惡性腫瘤80%以上為鱗狀細胞癌，5年生存率約為60%，且發病率呈逐漸上升趨勢［1］。目前針對OSCC 的研究較多集中于細胞凋亡和增殖的平衡機制方面，已證實凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）Livin及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）在上述過程中發揮重要作用。在乳腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、腦星形細胞瘤等多種惡性腫瘤組織中均發現Livin的表達［2－5］；Caspase-3作為半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，在細胞凋亡過程中發揮重要作用，而拮抗或抑制Caspase-3的活性可抑制細胞凋亡發生［6］。但二者在OSCC及正常口腔組織（NOT）中表達情況則少有報道，該實驗采用RTPCR技術檢測分析OSCC及NOT中Livin mRNA與Caspase-3 mRNA的表達程度，探討兩者在OSCC發生、發展中的作用及相互關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源選取2011年10月～2013年2月在安徽醫科大學第一附屬醫院口腔頜面外科就診，并均經組織病理檢查確診為OSCC患者新鮮組織標本45例，另選11例患者為陰性對照組（NOT組）。所有OSCC組患者均為首次確診，術前均未行放、化療或其他抗腫瘤治療，均無遠端臟器的轉移，無其他惡性腫瘤史，無家族腫瘤史。所有切取的45例OSCC組織中男28例，女17例；年齡43～79（43.21± 16.73）歲；依國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control，UICC）（2002）口腔癌TNM分類分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期15例；參照1997年世界衛生組織（World Health Organization，WHO）病理學標準分級：高分化29例，中低分化16例；伴有頸部淋巴結轉移18例，無淋巴結轉移者27例。另11例NOT組織標本中7例取自阻生齒拔除患者，4例取自牙槽嵴修整患者。所有標本均于術中取材后立即置于液氮中，然后移至－80℃超低溫冰箱中貯存備用。

1.2 主要試劑及儀器PCR試劑、逆轉錄試劑盒、TRIzol試劑、DNA Marker、Taq DNA聚合酶（Fermentas公司，美國）；TGL-16H冷凍離心機（黑馬儀器公司，中國）；瓊脂糖凝膠（OXOID公司，英國）；TGL-18R冷凍離心機、DYY-6B型穩壓穩流電泳儀（北京六一儀器廠）；溴化已錠（10 mg/ml）（Sigma公司，美國）；2720PCR儀器（ABI公司，美國）；GSM凝膠圖像分析管理系統（3.0）（美國SIM公司）。

1.3 實驗方法Livin與Caspase-3及內參β-action引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司運用Primer Premier 5.0軟件設計并合成引物，見表1。取備用組織100 mg按TRIzol法提取總RNA，用MMLV第1鏈cDNA合成試劑盒逆轉錄。RT-PCR：以逆轉錄產物2 L作為模板，選用PCR擴增試劑在PCR儀上進行PCR擴增，以β-actin為內參。在PCR儀中，Livin的擴增條件為：94℃45 s，退火53℃45 s，延伸72℃45 s，冰上冷卻，擴增35個循環；Caspase-3的擴增條件：94℃45 s，退火55℃45 s，延伸72℃45 s，冰上冷卻，擴增35個循環；內參β-actin的PCR擴增條件為：94℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃30 s，冰上冷卻，擴增30個循環。反應結束后，取適量PCR反應產物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色。用數字化凝膠成像系統采集圖像，半定量分析電泳條帶的灰度值。結果以目的條帶與內參條帶的灰度值的比值表示。每個樣本重復3次。

表1 Livin、Caspase-3及內參β-actin引物序列和片段長度

1.4 統計學處理應用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析，采用χ2檢驗分析Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC組織中的表達差異，兩種指標之間的表達相關性采用Pearson列聯系數相關分析。

2 結果

2.1 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA的在OSCC和NOT組織中的表達Livin mRNA與Caspase-3 mRNA RT-PCR產物電泳結果提示Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在NOT組織中均少量表達，但在OSCC中，Livin mRNA的表達量高于Caspase-3 mRNA，見圖1。Caspase-3 mRNA在OSCC與NOT組織中的表達量差異無統計學意義（P＞0.05），Livin mRNA在OSCC中的表達量（0.542± 0.074）高于NOT組織（0.181±0.026），差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC及NOT組織中的表達率，見表3。

圖1 RT-PCR檢測Livin mRNA與Caspase-3 mRNA的表達

表2 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC和NOT組織中的相對含量（±s）

表2 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC和NOT組織中的相對含量（±s）

與NOT組比較：▲▲P＜0.01

組別n Livin mRNACaspase-3 mRNA OSCC450.542±0.074▲▲0.102±0.025 NOT110.181±0.0260.193±0.031

表3 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC及NOT組織中的表達率［n（%）］

2.2 Livin mRNA、Caspase-3 mRNA表達與OSCC患者臨床病理參數的關系Livin mRNA在伴有淋巴結轉移、中低分化、Ⅲ～Ⅳ期的OSCC組織中的表達高于無淋巴轉移、高分化、Ⅰ～Ⅱ期的OSCC組織（P＜0.01）。Caspase-3 mRNA在伴有淋巴結轉移、中低分化、Ⅲ～Ⅳ期的OSCC組織中的表達低于無淋巴轉移、高分化、Ⅰ～Ⅱ期的OSCC組織（P＜0.05）。Livin mRNA與Caspase-3 mRNA的表達在OSCC患者年齡、性別參數方面的差異無統計學意義（P＞0.05）。說明Livin mRNA在OSCC組織中的相對含量，隨著OSCC組織分化的增高而增高，亦隨著組織學分級的增高而增高，且與淋巴結轉移有關，見表4。

表4 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC組織中的表達與臨床病理的關系（±s）

表4 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC組織中的表達與臨床病理的關系（±s）

項目nLivin mRNAt值P值Caspase-3 mRNAt值P值性別0.8720.388－0.1620.872男280.533±0.0800.101±0.023女170.555±0.0710.103±0.030年齡（歲）0.6820.278－0.1540.864＜54160.539±0.0610.099±0.019≥54290.543±0.0820.104±0.026分期－11.843＜0.0012.8390.007Ⅰ～Ⅱ300.395±0.0510.113±0.024Ⅲ～Ⅳ150.836±0.0820.081±0.028淋巴結轉移－10.209＜0.0013.2340.004無270.412±0.0650.115±0.025有180.737±0.0690.084±0.027分化程度－12.014＜0.0013.0050.001高分化290.399±0.0710.116±0.021中低分化160.801±0.0640.076±0.030

表5 Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC中表達的相關性

2.3 Livin mRNA、Caspase-3 mRNA在OSCC組織中表達的相關性在45例OSCC組織中，僅測得2例Livin mRNA與Caspase-3 mRNA同時表達，未測得兩基因同時不表達的組織。僅Caspase-3 mRNA表達者12例，僅Livin mRNA表達者31例。根據Pearson列聯系數相關分析，Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC組織中的表達呈相關關系，差異有統計學意義（P＜0.01），見表5。

3 討論

細胞凋亡是細胞的生理性死亡過程，它是受基因控制的，不但需要許多與免疫相關的凋亡信號介導，還需要凋亡誘導劑和抑制劑的參與來共同完成細胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，Caspase-3被激活后能水解大量蛋白底物，激活其他種類的Caspase，最終導致細胞凋亡［7］，說明Caspases-3對細胞凋亡是必需的。Caspase-3在OSCC組織中明顯降低，提示Caspase-3活化減少，不能引起足夠的細胞凋亡，使細胞異常增殖，引發癌變［8］。

Livin作為凋亡抑制基因，是近年來發現的凋亡抑制蛋白家族（IAPs）中的新成員。目前發現的人類IAP家族成員共有8個，其共同結構特點是N端有一個或多個（目前最多為3個）串聯的桿狀病毒IAP重復序列，C端含有或不含有一個環指結構［9］。Livin抑制細胞凋亡作用主要是通過其BIR區與Caspases家族結合，抑制其活性，尤其是抑制Caspases-3/-7和Caspases-9的活性，阻止Caspase蛋白在細胞凋亡時的正常功能［10］。因此，細胞凋亡途徑失去重要的酶，使凋亡酶依賴的細胞凋亡無法正常進行。

本研究結果提示，在OSCC組織中，Caspase-3 mRNA的陽性表達率明顯低于NOT組織，其相對含量也低于NOT組織，且隨著臨床分期的增加、腫瘤分化程度的降低，其相對含量也相應降低，而與年齡、性別因素無關。在NOT組織中，Caspase-3 mRNA的相對含量和表達率都比較高；而在OSCC組織中，Caspase-3 mRNA的表達較低。這與毛麗梅等［11］報道相似。提示Caspase-3可能在OSCC的發生、發展、侵襲和轉移機制中起抑制作用。

Schmollinger et al［12］研究發現Livin的表達缺失可使腫瘤實現免疫逃避，提示Livin或可作為腫瘤免疫治療的一個有效靶點。陶菲克等［13］研究發現皮膚鱗癌組織中Livin蛋白的陽性表達率為72.2%，提示Livin基因在皮膚鱗癌發生、發展中起作用。本實驗結果顯示，Livin在OSCC組織中陽性表達率高于NOT組織，并且其表達與OSCC的病理分期、分化程度及淋巴結轉移有關，提示Livin可能在OSCC的發展、浸潤、轉移中起重要作用，這與吳文新等［14］在大腸管狀腺瘤癌變中的研究一致，劉俊華等［15］在非小細胞肺癌中的研究也得出了類似的結論。

本研究表明，Livin mRNA在NOT中低表達或表達缺失，而在OSCC組織中的陽性表達率和相對含量明顯升高，差異有統計學意義；同時顯示Livin mRNA在伴有淋巴結轉移組的OSCC組織中，Livin mRNA的相對含量也高于無淋巴結轉移組，并且在OSCC組織中的相對含量與病理分化程度、臨床分期呈正相關，而與年齡、性別因素無關。提示Livin可能參與促進了OSCC的發生、發展，其或可作為評價OSCC臨床分期，評估其惡性程度及預后的一個有用指標，說明Livin在OSCC的發生、發展過程中起重要作用。Livin mRNA與Caspase-3 mRNA在OSCC組織中的表達呈相關關系，差異有統計學意義，提示Livin與Caspase-3在OSCC的發生、發展中可能存在相互抑制的作用。Caspase-3編碼的蛋白表達降低，從而減弱了其對Livin的抑制作用，而Livin表達增加，促進細胞增殖活性，過多的細胞凋亡抑制，引起細胞周期調控異常，使口腔黏膜上皮過度增生，在各種理化因素作用下最終發生癌變。本研究提示聯合檢測Livin與Caspase-3可以為OSCC臨床分級、分期、評估預后提供數據支持，但仍需大量的臨床數據進一步研究。

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Expression and relativity of Livin and Caspase-3 inhuman oral squamous cell carcinoma

Xie Chuanbin，Yan Yuchun
（Dept of Stomatology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the expression and relativity of Livin and Caspase-3 in oral squamous cell carcinoma（OSCC）.MethodsThe expression of Livin mRNA and Caspase-3 mRNA in 45 cases of OSCC and 11 cases of normal oral tissue were detected by reverse RT-PCR.ResultsThe positive expression rates of Livin mRNA in OSCC were significantlyhigher than those in normal oral tissue（P＜0.05）.Compared with those without lymph node metastasis in OSCC，the positive ratios of Livin mRNA with lymph node metastasis were significantlyhigher（P＜0.05）.The expressions of Livin were significantly related with pathological stage and the lymph node metastasis，but neither of them was correlated with sex and age.Correlation analysis showed that Livin expression level was related to Caspase-3 level（P＜0.01）.ConclusionThe abnormal expressions of Livin and Caspase-3 are closely related to the occurrence，progress and metastasis of OSCC，which can evaluate the degree of malignancy and prognosis of patients with OSCC reference.

oral squamous cell carinoma；inhibitor of apoptosis protein Livin；Caspase-3；RT-PCR

R 739.8

A

1000－1492（2014）04－0498－04

2013－12－05接收

安徽省衛生廳科研項目（編號：2010-B-15）

安徽醫科大學第一附屬醫院口腔科，合肥 230022

解傳斌，男，碩士研究生；顏雨春，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：99yyc＠sina.cn