HPLC檢測大鼠組織樣品中花椒麻素方法的建立

方國珊，張 磊，張端麗，周 敏，劉 雄,

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331）

花椒為蕓香科（Rutaceae）花椒屬植物Zanthoxylum bungeanum的果皮，是我國傳統(tǒng)的“八大調(diào)味品”之一，主要含有揮發(fā)油、生物堿、酰胺類物質(zhì)、香豆素等多種化學(xué)成分，對心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫機(jī)能、凝血功能等都有重要作用[1-6]。花椒麻素是一類鏈狀不飽和脂肪酸酰胺類物質(zhì)，具有強(qiáng)烈的刺激性[7-9]，目前已鑒定出22 種[10]，主要有α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素、δ-山椒素及其羥基同系物等，其檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層層析法、近紅外檢測法、紫外分光光度計法等[11-15]。國內(nèi)外對花椒麻素在生物樣品中檢測方法的研究報道較少，有文獻(xiàn)報道，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定大建中湯中羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素及γ-山椒素在血漿、尿液中的含量[16]，前處理簡便、靈敏度高，但設(shè)備昂貴、檢測成本高，Munekage等[17]采用高效液相色譜測定大建中湯中羥基-α-山椒素及羥基-β-山椒素在血漿中的濃度，所需樣品量少，分離效果好，但組織樣品中干擾雜質(zhì)較多，已報道的檢測方法效果并不理想，而目前組織樣品中花椒麻素的檢測方法尚未見報道，故本實(shí)驗旨在建立組織樣品中花椒麻素含量的檢測方法，以期為花椒麻素進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒麻素標(biāo)品（純度＞97%） 實(shí)驗室自制；五味子醇甲（純度＞98%） 南通飛宇生物科技有限公司；甲醇 美國Spectrum公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀（配有LC-20AD泵、SPDM20A檢測器、SIL-20A全自動進(jìn)樣器、CTO-10AS柱溫箱及LCsolution工作站） 日本島津公司；XW280A旋渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；Eppendorf Centrifuge 5810型離心機(jī) 德國Eppendorf公司；1-15 PK冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；JA2003A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；Cole Parmer手持勻漿機(jī) 美國Cole-Parmer儀器公司；HH-4水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Milli-Q Biocel超純水器 美國密理博公司。

1.3 動物

SD大鼠，雄性、體質(zhì)量（220±20）g、SPF級，購于重慶騰鑫比爾實(shí)驗動物銷售有限公司，動物許可證號：SCXK（渝）2007-0008。大鼠單籠飼養(yǎng)，室溫保持（25±1）℃，12 h明暗輪換（8∶00～20∶00），基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)適應(yīng)一周后，按照40 mg/kg體質(zhì)量的劑量灌胃大鼠，15、30、45、60、90、180、360 min及12 h后斷頭處死，立刻解剖取樣，胃和小腸需剪開洗出內(nèi)容物，皮膚需刮凈，其余組織直接用冰冷的生理鹽水洗去表面血液，草紙輕輕吸干后稱量，鋁箔紙包裹后置于－80 ℃待測。同樣的方法采集未灌胃的正常大鼠的組織樣品作為空白組織。

1.4 花椒麻素測定方法的建立

1.4.1 色譜條件

色譜柱：島津Interstil ODS-SPC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶水=70∶30（V/V）；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：254 nm。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

花椒麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取花椒麻素適量，用甲醇溶解配制成2 mg/mL的儲備液。分別精密量取該儲備液適量，用流動相逐級稀釋成質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/mL和200 μg/mL的花椒麻素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置冰箱（4 ℃）備用。

內(nèi)標(biāo)液：精密稱取五味子醇甲0.006 0 g，用甲醇溶解配制成60 μg/mL備用。

1.4.3 生物樣品的處理方法

取組織樣品（腦、心、胃、脾、肺、腎、胰腺、皮膚、平滑肌、脂肪、睪丸和前列腺）加入5 mL甲醇和20 μL內(nèi)標(biāo)五味子醇甲（60 μg/mL），肝和小腸加入30 mL甲醇和20 μL五味子醇甲（60 μg/mL）。勻漿，靜置4 h，8 000 r/min離心10 min，合并兩次組織勻漿液于65 ℃烘干。加入1 mL甲醇，渦旋混合30 s，10 000 r/min冷凍離心10 min，過0.45 μm有機(jī)濾膜進(jìn)樣。

1.4.4 生物樣品中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用空白組織勻漿液配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、50、100 μg/mL 9 個梯度的花椒麻素標(biāo)準(zhǔn)液樣品，按上述方法進(jìn)行處理測定，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 回收率的測定

用大鼠空白組織勻漿液配制質(zhì)量濃度分別為1、5、10 μg/mL的組織樣品，加入內(nèi)標(biāo)20 μL，按1.4.3節(jié)操作，每添加量進(jìn)行5樣本分析。與相應(yīng)質(zhì)量濃度的純品溶液加入內(nèi)標(biāo)，對比。測定提取樣品峰面積Ax和純品峰面積As，按下式計算樣品提取回收率（R/%）：

1.4.6 方法的精密度

用大鼠空白組織勻漿液配制1、5、10、50、100 μg/mL 5個質(zhì)量濃度的組織樣品，按1.4.3節(jié)處理，每個質(zhì)量濃度進(jìn)行樣本分析，連續(xù)測定3 d，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時進(jìn)行。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算組織樣品的質(zhì)量濃度，計算方法的精密度。方法的精密度用日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和日間RSD表示。

1.4.7 穩(wěn)定性考察

取潔凈的離心管，加入空白大鼠組織勻漿液，加標(biāo)準(zhǔn)品使質(zhì)量濃度分別為1、5、10、50、100 μg/mL，分別放置－20 ℃冰箱冷藏1月；－20 ℃和室溫反復(fù)凍融3次，每個過程12 h；室溫20 ℃擺放12、24 h，同1.4.3節(jié)處理，測定藥物含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法專屬性考察

取大鼠空白組織勻漿液1 mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液，按1.4.3節(jié)方法操作，獲得空白樣品色譜圖1A；將一定質(zhì)量濃度的花椒麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白組織勻漿液，依同法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖1B；取大鼠給藥后的組織勻漿液，依法操作，可得給藥后大鼠組織樣品的色譜圖1C（以肝為例）。可見，花椒麻素的保留時間約為23.1、24.2 min和25.5 min，內(nèi)標(biāo)的保留時間約為17.3 min，組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾花椒麻素及內(nèi)標(biāo)的測定。

圖1 花椒麻素在肝組織中的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of alkylamide from Sichuan pepper in rat liver samples

2.2 組織樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.4.3節(jié)組織樣品處理方法提取樣本，得到大鼠組織樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由表1可知，花椒麻素在大鼠不同組織中的線性范圍略有不同，心臟、脾臟、肺、腦、肌肉、皮膚、睪丸及前列腺的線性范圍為0.1～10 μg/mL，腎臟和脂肪的線性范圍為0.1～20 μg/mL，肝臟和小腸的線性范圍為0.1～50 μg/mL，胃中花椒麻素的線性范圍為0.1～100 μg/mL，定量限（RSN=3）均為0.1 μg/mL。

2.3 加標(biāo)回收實(shí)驗

表2 花椒麻素在大鼠組織樣品中的提取回收率（n=5）Table 2 Recovery rates of alkylamide from Sichuan pepper in spiked samples of rat tissues (n=5)

續(xù)表2

表2表明：肝臟、脾臟、腎臟及肺中的回收率大于82%，其余組織樣品中的回收率均大于85%，RSD均小于9%，本方法在低、中、高3個添加水平上的回收率最低為78.79%，能滿足生物樣品的定量分析要求[18]。

2.4 精密度

本實(shí)驗通過日內(nèi)、日間變異考察了方法的精密度，由表3可知，方法的日內(nèi)RSD小于7%，日間RSD小于11%，完全符合目前生物分析方法指導(dǎo)原則質(zhì)控樣品批內(nèi)及批間RSD值不超過15%的要求[19]。

表3 花椒麻素精密度（n=5）Tabbllee 3 Precision of the method (n=5)

2.5 穩(wěn)定性

表4 穩(wěn)定性結(jié)果（n=5）Table 4 Stability of alkylamide from Sichuan pepper during storage at room temperaturree (n=5)

由表4可知，短期室溫放置穩(wěn)定性中，組織樣品中花椒麻素測定均值與加入值之間的RSD小于6%，表明組織樣品處理后室溫條件下至少可穩(wěn)定24 h；－20 ℃室溫反復(fù)凍融3次后，組織樣品的RSD小于10%，表明組織樣品在冷凍-融溶循環(huán)3次實(shí)驗中無明顯降解；貯藏1個月的組織樣品RSD小于8%，1 μg/mL的組織樣品貯藏1個月后，質(zhì)量濃度與初始樣品存在顯著性差異，而樣品質(zhì)量濃度在5～100 μg/mL時，無顯著性變化，說明低質(zhì)量濃度的樣品不宜貯藏，樣品處理后應(yīng)盡快測定。

3 討論及結(jié)論

3.1 試驗方法的選擇

花椒麻素的檢測方法包括紫外分光光度計法、近紅外檢測法、薄層層析法、高效液相色譜法等[11-15]。高效液相色譜具有分析成本低、靈敏度高、層析時間短、試驗方法簡便等優(yōu)點(diǎn)，對一些高熔點(diǎn)、低揮發(fā)、極性強(qiáng)以及對熱不穩(wěn)定的物質(zhì)具有良好的分離效果，并能在室溫中操作，安全簡便[20]，故本研究采用此種方法。

3.2 色譜條件的確定

本實(shí)驗選擇島津I n t e r s i l O D S-S P C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為分析柱，在一定比例范圍內(nèi)考察甲醇-水流動相對檢測色譜峰的影響。以峰面積為指標(biāo)，對比不同流速（0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.90、1.00 mL/min）及不同比例（55∶45、60∶40、62∶38、65∶35、68∶32、70∶30、72∶28、75∶25）的流動相的色譜圖，結(jié)果表明，隨著流速的提高，出峰時間不斷提前，峰面積逐漸減小，難以與內(nèi)標(biāo)及內(nèi)源性雜質(zhì)分離，而隨著有機(jī)相比例的提高，峰面積先增后減，當(dāng)甲醇和水比例70∶30、流速0.5 mL/min時，峰形對稱，花椒麻素和內(nèi)標(biāo)均達(dá)到基線分離，組織樣品中的其他成分不干擾樣品的測定。

3.3 樣品的處理方法

花椒麻素醇溶性強(qiáng)，在選取萃取溶劑時，曾采用乙醚、氯仿、氯仿-丙酮（1∶1、2∶1）、氯仿-甲醇（1∶1、1∶2、2∶1）、甲醇8種，乙醚等極性小的溶劑對其萃取率雖然高，但乙醚易揮發(fā)，從而造成提取后質(zhì)量濃度的誤差，不便于操作，且對呼吸道有強(qiáng)烈刺激作用，氯仿和丙酮或甲醇不同比例的提取溶劑，僅對個別組織的提取效率高，故選用甲醇為提取溶劑，成本低，提取率高，提純后雜質(zhì)少，操作十分方便。

本實(shí)驗建立了以五味子醇甲為內(nèi)標(biāo)，高效液相色譜法測定大鼠組織樣品中花椒麻素的含量方法，簡便快速、重復(fù)性好、靈敏度高，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回收率高，無干擾，適用于大鼠組織樣品中花椒麻素含量的測定。

[1]WU Tingting, HOU Aijun, HONG Zhenyi, et al.Extracts ofZanthoxylum bungeanumregulate cholesterol accumulation induced by sterols and LPSin vitroandin vivo[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2012, 21(6): 582-590.

[2]CHU Chinying, LEE H J, CHU C Y, et al.Protective effects of leaf extract ofZanthoxylum ailanthoideson oxidation of low-density lipoprotein and accumulation of lipid in differentiated THP-1 cells[J].Food and Chemical Toxicology, 2009, 47(6): 1265-1271.

[3]GONG Youwen, HUANG Yongfu, ZHOU Ligang, et al.Chemical composition and antifungal activity of the fruit oil ofZanthoxylum bungeanumMaxim.(Rutaceae) from China[J].Journal of Essential Oil Research, 2009, 21(2): 174-178.

[4]CHOU S T, CHAN H H, PENG H Y, et al.Isolation of substances with antiproliferative and apoptosis-inducing activities against leukemia cells from the leaves ofZanthoxylum ailanthoidesSieb.&Zucc[J].Phytomedicine, 2011, 18(5): 344-348.

[5]PEREIRA S S, LOPESA L S, MARQUES R B, et al.Antinociceptive effect ofZanthoxylum rhoifoliumLam.(Rutaceae) in models acute pain in rodents[J].Journal of Ethnopharmacology, 2010, 129(2): 227-231.

[6]VILLALBA M A, CARMO M I, LEITE M N, et al.Atividades farmacológicas dos extratos deZanthoxylum chiloperone(Rutaceae)[J].Revista Brasileira de Farmacognosia, 2007, 17(2): 236-241.

[7]ALBIN K C, SIMONS C T.Psychophysical evaluation of a sanshool derivative (alkylamide) and the elucidation of mechanisms subserving Tingle[J].PLoS ONE, 2010, 5(3): e9520.

[8]LENNERTZ R C, TSUNOZAKI M, BAUTISTA D M, et al.Physiological basis of tingling paresthesia evoked by hydroxy-αsanshool[J].The Journal of Neuroscience , 2010, 30(12): 4353-4361.

[9]KLEIN A H, SAWYER C M, ZANOTTO K L, et al.A tingling sanshool derivative excites primary sensory neurons and elicits nocifensive behavior in rats[J].Journal of Neurophysiol, 2011, 105(4):1701-1710.

[10]王宇, 王釗.花椒屬植物中生物活性成分研究近況[J].中草藥, 2002,33(7): 93-97.

[11]雷紹榮, 歐陽華學(xué), 趙志峰.反相高效液相色譜法測定花椒油中麻味成分[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2005, 18(6): 264-266.

[12]SUGAI E, MORIMITSU Y, KUBOTA K.Quantitative analysis of sanshool compounds in Japanese pepper (Xanthoxylum piperitumDC.)and their pungent characteristics[J].Bioscience Bioechnology and Biochemistry, 2005, 69(10): 1958-1962.

[13]劉雄.花椒風(fēng)味物質(zhì)的提取與分離技術(shù)的研究[D].重慶: 西南大學(xué),2003.

[14]付陳梅, 闞建全, 劉雄, 等.紫外分光光度計法測定花椒油中酰胺類物質(zhì)含量[J].中國食品添加劑, 2003(6): 100-102.

[15]祝詩平, 王剛, 楊飛, 等.基于近紅外光譜的花椒麻味物質(zhì)快速檢測方法[J].紅外與毫米波學(xué)報, 2008, 27(2): 129-132.

[16]IWABU J, WATANABE J, HIRAKURA K.Profiling of the compounds absorbed in human plasma and urine after oral administration of a traditional Japanese (Kampo) medicine,daikenchuto[J].Drug Metabolism and Disposition, 2010, 38(11):2040-2048.

[17]MUNEKAGE M, KITAGAWA H, ICHIKAWA K, et al.Pharmacokinetics of daikenchuto, a traditional Japanese medicine (Kampo)after single oral administration to healthy Japanese volunteers[J].Drug Metabolism and Disposition, 2011, 39(10): 1784-1788.

[18]國家藥典委員會.藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導(dǎo)原則[M]//中華人民共和國藥典: 二部.2010年版.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 附錄195-199.

[19]鐘大放, 李高, 劉昌孝.生物樣品定量分析方法指導(dǎo)原則(草案)[J].藥物評價研究, 2011, 34(6): 409-415.

[20]王慧文.高效液相色譜技術(shù)在藥品檢驗中的應(yīng)用及進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥, 2008, 12(11): 1087-1090.