細胞周期素G1與三陰乳腺癌不良預后關系的研究

韓 濤，劉兆喆，郭 放，韓雅玲，謝曉冬

乳腺癌在我國發病率位居女性惡性腫瘤之首，病死率僅次于肺癌，其發生發展是多因素參與并相互作用的復雜過程［1］。涉及癌細胞本身、癌細胞與癌周微環境及宿主免疫狀態的多因素異常參與了乳腺癌的不良預后。國內外研究發現不少的癌基因、生長因子等與乳腺癌細胞復發轉移密切相關，可能成為乳腺癌的預后判斷指標［2］。但因傳統的臨床預后指標有其自身的局限性，尚不能完全反映乳腺癌的生物學特性。隨分子生物學技術的發展，乳腺癌發生發展的分子機制被逐步闡明，尋找相關標志物和干預靶點一直以來都是乳腺癌研究的熱點。細胞周期素 G1(cyclin G1)基因是1993年 Tamura等［3］在鼠成纖維細胞中尋找新的Src家族成員過程中發現的，定位于染色體5q32-q34區域。有6個外顯子，其cDNA 長約3．17 kb［4］。作為一種新的細胞周期素，cyclin G1 通過與 MDM2［5］、PP2A［6］等分子相互作用，參與了細胞多種生物學過程，如細胞周期和增殖［7-9］、DNA 損傷修復［10］、細胞凋亡［9，11-12］等。更重要的是，cyclin G1與抑癌基因p53關系密切，cyclin G1與p53結合，形成交互負反饋調節，提示該分子的異常表達可能在腫瘤發生發展中起到了重要作用。近年來研究證實，cyclin G1高表達對成骨肉瘤細胞、結腸癌細胞、伯基特淋巴瘤等腫瘤細胞的生長有促進作用，并且與急性淋巴細胞白血病、慢性粒細胞白血病等惡性血液病密切相關［13-15］。本研究主要分析乳腺癌中cyclin G1的表達及其臨床意義，同時我們在此基礎上也初步評價了cyclin G1作為乳腺癌預后指標和干預靶點的價值，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料和標本收集 收集2003年1月—2008年10月，沈陽軍區總醫院的78例女性乳腺癌手術切除冰凍組織、石蠟標本及患者的相關臨床病理資料。患者29～83歲，中位年齡49歲，術前均未進行任何放化療及生物治療，術后病理診斷均為浸潤性乳腺癌，隨訪120個月，中位生存時間101個月。在這78例乳腺癌組織中隨機選取22例乳腺癌及其癌旁組織抽提RNA，反轉錄成cDNA，進行轉錄水平的分析實驗。

1.2 主要抗體及試劑 兔抗人cyclin G1多克隆抗體(Santa Cruz公司);甲醇(上海試劑一廠，AR);無水乙醇(上海試劑一廠，AR);Syrb green(QIAGEN公司)。

1.3 儀器設備 熒光實時定量PCR儀(Applied Biosystems公司)，免疫組化石蠟包埋機和免疫組化制片儀(Leica公司)。

1.4 實時熒光定量PCR(Realtime RT-PCR)檢測Realtime RT-PCR檢測乳腺癌及癌旁組織中cyclin G1 mRNA的表達，將上述組織碾碎分裝在1．5 ml Ep管中，用TRIzol?reagent收集組織，據試劑說明的步驟抽提RNA并做反轉錄，得到cDNA用于熒光定量PCR檢測。目的基因的相對表達量經內參標化后分析。最終獲得其相對定量值，用癌減去癌旁的相對定量值取對數。使用的引物由上海生工生物技術有限公司合成。cyclin G1上游引物序列:5'-AAGCAGCTCAGTCCAACACA-3';cyclin G1下游引物序列:5'-TGGCTTTGACACAGAGACATTT-3'，以人β-actin作為內參，引物的上游序列:5'-GGCATCGTGATGGACTCCG-3'，下游序列:5'-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3。PCR擴增條件:94℃預變性10 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，72℃延伸30 s，40個循環，72℃終末延伸10 min。

1.5 免疫組織化學染色及結果判定 所有標本均行4 mm連續切片，石蠟包埋，應用cyclin G1多抗進行免疫組化SP法染色。具體操作步驟:石蠟切片脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10 min，以清除內源性過氧化物酶的活性;抗原微波熱修復3 min，抗原修復液為pH 6．0檸檬酸緩沖液;3．5% ～10%正常山羊血清封閉非特異性位點，室溫孵育10 min;傾去血清，滴加cyclin G1一抗工作液，37℃孵育過夜;滴加生物素標記的二抗工作液，濕盒中孵育20 min;滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，濕盒中孵育20 min。上述步驟之間均用0．01 M PBS(pH=7．4)沖洗。進行DAB染色，自來水沖洗、蘇木素復染細胞核、封片。結果判定:細胞胞漿或細胞膜呈清晰黃褐色顆粒為陽性表達。高倍鏡(×400)下隨機觀察5個視野，根據陽性細胞百分率和染色強度進行半定量分析，染色強度:無染色0分，染色弱但強于陰性對照記1分，染色清晰記2分;陽性細胞數 ＜10%記0分，10% ～25%記1分，25% ～50%記2分，＞50%記3分。兩項指標積分之和0～1分為陰性病例(－)，1～2分為弱陽性病例(+)，2～3分為陽性病例(++)，≥3分為強陽性病例(+++)。由兩位病理科醫師雙盲法計數，差異超過10%需重新計數［16］。

1.6 統計分析方法 應用SPSS 18．0軟件進行數據分析。計量資料的均數比較采用t檢驗，計數資料的生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用Log rank檢驗。將單因素分析中有意義的各變量用向后逐步回歸法進行Cox比例風險模型分析。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 cyclin G1在乳腺癌組織及其癌旁組織中的表達情況 組織學水平上檢測了78例乳腺癌及其癌旁組織中cyclin G1的表達情況，見圖1，cyclin G1在乳腺癌中的表達評分為(1．93±0．77)分，顯著高于癌旁組織中的表達評分(1．31±0．67)分，差異有統計學意義(P ＜0．01)。

2.2 Realtime-PCR實驗 cyclin G1在18例乳腺癌中的表達(81．8%)高于癌旁組織中的表達，見圖2，其中癌組織中cyclin G1表達為3．62±1．64，癌旁組織中cyclin G1表達為2．96±1．93，兩組比較差異有統計學意義(P ＜0．01)。

2.3 cyclin G1的表達與臨床病理特征 以本組乳腺癌組織中cyclin G1表達評分的中位數為界值(中位數為2)，高于此界值定義為cyclin G1高表達組，低于此界值定義為cyclin G1低表達組。cyclin G1高、低表達組的臨床特征如下表1，三陰乳腺癌患者主要集中在cyclin G1高表達組(93．3%)，其中高表達組中cyclin G1表達量為2．52±0．44，低表達組中cyclin G1 表達量為1．32±0．54，cyclin G1 高低兩組間具有統計學差異(P＜0．05)。

圖1 細胞周期素G1在乳腺癌組織及其癌旁組織中的表達(DAB×200) A．乳腺癌;B．癌旁組織

圖2 細胞周期素G1在22例乳腺癌組織中的表達

2.4 cyclin G1表達和預后生存時間 乳腺癌組織中cyclin G1低表達者與高表達者相比，其5年總體生存率有顯著統計學差異(P＜0．05)，見圖3。cyclin G1高表達組生存期為(81．282±38．782)個月，低表達組生存期為(95．538±30．783)個月，乳腺癌組織中cyclin G1表達越高，預后越差。

2.5 cyclin G1表達與三陰乳腺癌的生存分析 將cyclin G1的表達與乳腺癌是否三陰進行聯合分析發現cyclin G1高表達的三陰乳腺癌患者預后最差(中位生存期49個月)，cyclin G1低表達的三陰乳腺癌患者和cyclin G1高表達的非三陰乳腺癌患者預后也較差，cyclin G1低表達的非三陰乳腺癌預后最好(中位生存期117個月)。總之，cyclin G1高表達的三陰乳腺癌患者、cyclin G1低表達的三陰乳腺癌患者、cyclin G1高表達的非三陰乳腺癌患者、cyclin G1低表達的非三陰乳腺癌患者預后之間進行多重比較均具有統計學差異(P＜0．05)，見圖4。

2.6 cyclin G1表達與預后 通過Chi-square檢驗對影響乳腺癌患者總體生存期的臨床各種指標行單因素分析，結果如表2所示;通過單因素分析篩選出對乳腺癌總體生存期有意義的變量納入多因素分析，通過建立Cox比例風險模型進行統計，提示乳腺癌中cyclin G1表達對于總體生存率為獨立的預后因子，乳腺癌組織中cyclin G1高表達者相對cyclin G1低表達者對于總體生存率的相對危險度HR=2.837，95%可信區間為1．196 ～6.728，P=0．02。

表1 細胞周期素G1高、低表達組乳腺癌的臨床特征［例(%)］

圖3 細胞周期素G1的表達與乳腺癌預后的相關性分析

圖4 細胞周期素G1的高低表達與是否為三陰乳腺癌聯合分析對預后的影響

表2 變量的單因素分析和多因素分析

3 討論

乳腺癌在發達國家居女性腫瘤第一位［17］，新研究提示某些癌基因及受體的表達不僅能夠判定乳腺癌的預后，而且對指導乳腺癌治療具有重要意義。cyclin G1是發現較晚的一類細胞周期蛋白，被報道可以和 MDM2［5］，PP2A［6］等分子相互作用，廣泛參與了細胞多種病理生理過程，在細胞凋亡、周期調控和DNA損傷修復等過程發揮重要作用。一系列研究發現，cyclin G1在多種腫瘤的發生發展過程中發揮了重要的作用，cyclin G1的高表達對成骨肉瘤細胞、結腸癌細胞、淋巴瘤細胞的生長有促進作用，另外其與急性淋巴細胞白血病、慢性粒細胞白血病等血液系統惡性腫瘤有關。最新的研究表明，cyclin G1還參與調控肝癌細胞的上皮間質轉化和復發轉移的過程［18］，并對肝癌起始細胞起到了促進和維持作用［19］。盡管cyclin G1已被證明是重要的腫瘤調節蛋白，但是其在乳腺癌中的表達及和乳腺癌患者預后的關系國內外尚無任何報道。本研究首先在78例乳腺癌和癌旁組織中進行組織學檢測并在22例乳腺癌和癌旁組織中進行cyclin G1的轉錄水平檢測，結果均支持cyclin G1在乳腺癌中表達顯著高于癌旁組織中的表達，這提示我們cyclin G1有可能在乳腺癌發生發展中發揮重要癌基因的作用。

在前期實驗的基礎上我們又進一步分析了cyclin G1的表達和乳腺癌患者預后的關系，通過生存分析發現，乳腺癌組織中cyclin G1表達和預后呈負相關，cyclin G1高表達者與低表達者相比，其5年總體生存率明顯降低，結果具有顯著統計學差異(P＜0．05)。據研究顯示，按照激素受體分子分型，乳腺癌中還存在一種特殊的亞型，三陰乳腺癌［20］，即ER、PR、HER-2表達均為陰性的乳腺癌，約占乳腺癌的15%，因其浸潤性較強、缺乏內分泌及分子靶向治療常常與復發轉移率高、生存時間短等不良預后相關［21-22］。我們在研究中著重分析了cyclin G1分子在三陰乳腺癌和非三陰乳腺癌中的表達變化，結果顯示cyclin G1在三陰乳腺癌中表達明顯高于非三陰乳腺癌，這提示cyclin G1有可能參與了三陰乳腺癌細胞的惡性生物學行為。而當我們將cyclin G1與三陰乳腺癌聯合起來對乳腺癌預后進行分析判斷時發現cyclin G1高表達的三陰乳腺癌患者預后最差，cyclin G1低表達的三陰乳腺癌患者和cyclin G1高表達的三陰乳腺癌患者預后也較差，cyclin G1低表達的非三陰乳腺癌預后最好;這提示cyclin G1的表達與乳腺癌是否三陰相結合判斷可以顯著提高乳腺癌的預后判斷效果。

綜上所述，本研究探討了cyclin G1與乳腺癌表達及預后的關系，從基因水平和組織學水平檢測了乳腺癌樣品中cyclin G1的表達情況，并結合乳腺癌患者的預后隨訪資料分析臨床樣本中cyclin G1的表達情況與預后的關系，并進一步分析cyclin G1與三陰乳腺癌的預后聯合判斷效果。為cyclin G1作為臨床上乳腺癌預后判斷指標和治療靶點奠定理論基礎，并為乳腺癌患者的個體化治療和預后判斷提供重要的理論意義和潛在臨床應用價值。

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