Fractalkine/CX3CR1參與骨髓間充質干細胞向缺血腦組織定向遷移的實驗研究

朱 潔，周華東

骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)具有很強的自我更新能力和多向分化潛能，在一定條件下能夠誘導分化為神經細胞，發揮神經細胞替代和組織修復功能［1-7］。越來越多的研究發現移植BMSCs具有向腦損傷病灶定向遷移的趨勢［8-12］，但其確切機制仍不明確，闡明其機制有助于采取積極手段促進移植BMSCs向病灶遷移，提高移植治療效果。趨化因子fractalkine，是為數不多組成性的表達于中樞神經系統中的趨化因子之一［13-14］。fractalkine和其唯一的受體CX3CR1相互作用，可通過提高細胞黏附和促進CX3CR1陽性細胞的跨膜轉移在組織損傷中發揮作用［15-17］。

本課題組前期試驗中發現，大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中fractalkine表達增高，可能參與介導靜脈移植人骨髓間充質干細胞(human bone marrow stromal cells，hMSCs)向腦損傷區的定向遷移［18］。本研究利用Transwell小室建立體外遷移模型進一步觀察fractalkine和其受體CX3CR1是否參與介導BMSCs向腦缺血組織的定向遷移，以此進一步解釋移植BMSCs向腦損傷局部遷移的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康雄性SPF級SD大鼠，3～4月齡，體重270～300 g，以及2周齡SD大鼠幼鼠，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。胎牛血清(FBS)購自天津灝洋生物制品有限公司;胰蛋白酶購自Amresco公司;DMEM高糖培養基購自Hyclone公司;FITC標記的小鼠抗大鼠 CD44、CD90、CD71、CD11b抗體、同型對照購自Serotec公司;重組大鼠fractalkine購自R＆D公司;CX3CR1抗體購自Abcam公司;SYBR Prime Script RT-PCR Kit購自TaKaRa公司;SP-9001免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司;Transwell小室聚碳酸酯膜(孔徑為8μm)購自BD Biosciences公司。

1.2 BMSCs的分離純化、培養及鑒定 2周齡大鼠幼鼠10只脫頸處死，無菌條件下分離雙側股骨，剪開干骺端，用注射器抽取0．01 mol/L PBS反復沖洗骨髓腔，制成單細胞懸液，將細胞懸液于 4℃、1000 r/min離心5 min共2次;棄上清后用含10%FBS的DMEM高糖培養基重新懸浮細胞接種到50 ml培養瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的孵育箱內培養。24 h后更換新鮮培養液，去除未貼壁細胞，以后每3 d換液1次，10～14 d后傳代培養。貼壁細胞約80% ～90%爬滿培養瓶底時用0．25%胰酶消化，按104/ml密度傳代接種。

用倒置相差顯微鏡逐日觀察細胞的生長情況和形態特征。取生長良好的第3～5代細胞，充分懸浮后制成單細胞懸液，以FITC標記的小鼠抗大鼠CD44、CD90、CD71、CD11b 抗體室溫避光染色30 min，設立不加抗體的陰性對照;使用 Becton-Dickinson FAC Scan檢測，Apple公司隨機軟件分析，每個樣本分析10 000個細胞。

1.3 體外培養BMSCs表達CX3CR1的情況

1.3.1 RT-PCR檢測CX3CR1 mRNA表達:取生長良好的第3～5代細胞，采用Tripure RNA抽提試劑提取細胞總RNA。紫外分光光度計(Beckman Du 800)測定 RNA 純度及濃度，A260/280為1．8～2．0可用以實驗。RNA統一定量為1．0μg后進行反轉錄反應。CX3CR1(140 bp)引物為:上游5'-AGCTGCTCAGGACCTCACCAT-3'，下游 5'-GTTGTGGAGGCCCTCATGGCTGAT-3';條件如下:42℃，30 min;95℃，5 min;5℃，5 min。待 RNA反轉錄為 cDNA后，以20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果在GENEGENUS數碼成像及分析系統中觀察、拍照。

1.3.2 免疫細胞化學方法檢測CX3CR1表達:取生長旺盛的第3～5代細胞，以兔抗CX3CR1多克隆抗體(1∶200)，按照SP 9001試劑盒操作說明進行SP 3步法免疫組化染色，以蘇木素染液復染核;陰性對照以0．1 mol/L PBS代替一抗，其余步驟不變。

1.4 大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型的制備 參照Nagasawa線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型［19］(栓塞右側大腦中動脈)。術后2 h，拔出線栓，實現再灌注。動物蘇醒后參照Longa等方法進行5分制評分［20］，2～3分者為實驗對象。經解剖發現蛛網膜下腔出血者不計入實驗組。

1.5 腦組織勻漿上清液制備 正常對照組(正常對照組大鼠不做處理6只)及大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型大鼠(以再灌注不同時間24 h、72 h、7 d)各6只分別于規定時間點斷頸處死，無菌條件下迅速摘取前腦(耳間線2～12 mm)，置冰上，迅速稱重，加入 DMEM培養基，勻漿，4℃以12 000 r/min，離心15 min，收集上清。

1.6 Transwell實驗檢測細胞遷移能力

1.6.1 不同濃度重組大鼠FKN對BMSCs遷移的影響:將PBS(正常對照組)及濃度分別為50、100、200、500 ng/ml重組大鼠fractalkine置于chamber下層，將2×105/ml BMSCs細胞懸液50μl(總細胞數104)于chamber上層，加入等量DMEM高糖培養基于37℃培養箱中，孵育18 h。取出Transwell小室用PBS洗2遍，于4℃體積分數90%乙醇固定;加入結晶紫(0．1%)染色(5 ～10 min)，室溫 0．5 h，PBS 洗2遍，用棉球擦去上表面細胞，40倍顯微鏡下觀察。每孔取中間和四周5個隨機視野，計算染色細胞總數。

1.6.2 不同再灌注時間缺血大鼠腦組織萃取液對BMSCs遷移的影響:將正常大鼠腦組織(對照)及再灌注24 h、72 h、7 d MCAO大鼠腦組織萃取液置于chamber下層，將2×105/ml BMSCs細胞懸液50μl(總細胞數 104)置于 chamber上層，加入等量DMEM高糖培養基孵育18 h后計數遷移至濾膜下方的細胞數，每孔取中間和四周5個隨機視野。取最大黏附效應的時間點行阻斷實驗。

1.6.3 阻斷CX3CR1對BMSCs向缺血腦組織萃取液遷移的影響:阻斷組BMSCs于遷移誘導培養前預先以5μg/ml CX3CR1抗體于室溫下孵育30 min，將腦缺血大鼠腦組織萃取液置于chamber下層，將正常組及CX3CR1阻斷組2×105/ml BMSCs細胞懸液50μl(總細胞數104)置于chamber上層，加入等量DMEM高糖培養基孵育18 h后計數遷移至濾膜下方的細胞數，每孔取中間和四周5個隨機視野。1.7 統計學處理 所得數據均采用均數±標準差(±s)表示，兩組均數比較，應用SPSS 18.0統計軟件包行t檢驗，α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 BMSCs的分離純化及鑒定 第3～5代的BMSCs細胞形態呈成纖維細胞樣，細胞呈極性排列，集落呈漩渦狀(圖1)。經流式細胞儀檢測，BMSCs均一地表達 CD44、CD90和 CD71，陽性率分別為98.4%、99．7%和99．6%;而CD11b 陽性率僅0.6%(圖2)。

圖1 相差顯微鏡觀察第4代骨髓間充質干細胞(×100)

圖2 骨髓間充質干細胞表面標記物流式細胞儀分析圖

2.2 BMSCs CX3CR1 mRNA和蛋白的表達 RTPCR瓊脂糖凝膠電泳結果顯示:320 bp特異性擴增條帶，與預期趨化因子受體CX3CR1擴增片段一致(圖3A)。免疫組化結果發現CX3CR1主要表達于BMSCs的胞膜和胞漿(圖3B)，空白對照未見陽性著色。

圖3 CX3CR1在骨髓間充質干細胞的表達

2.3 fractalkine和缺血腦組織萃取液對BMSCs的定向趨化作用

2.3.1 不同濃度重組大鼠fractalkine對BMSCs遷移的影響:在重組 fractalkine濃度為50、100 ng/ml的作用下，遷移至下層chamber的BMSCs分別為(1．02 ±0．39)×103與(1．53 ±0．14)×103，和 PBS對照組(0．85±0．22)×103相比無明顯差異。而在200、500 ng/ml作用下，有較多量的BMSCs實現遷移，分別為(2．27 ±0．66)×103和(2．92 ±0．83)×103，與對照組相比有顯著差異(P＜0．05)。

2.3.2 不同再灌注時間缺血大鼠腦組織萃取液對BMSCs遷移的影響:與正常對照組相比，大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型組術后24 h大鼠腦組織萃取液所誘導的 BMSCs遷移(0．73±0．28)×103與正常對照組(0．52±0．08)×103相比未見顯著性差異(P＞0．05)。術后72 h和7 d大鼠腦組織萃取液所誘導的遷移 BMSCs分別為(1．39±0．33)×103和(1．74 ±0．31)×103，與正常對照組相比有顯著差異(P ＜0．05)。

2.3.3 阻斷CX3CR1對BMSCs向缺血腦組織萃取液遷移的影響:以CX3CR1抗體阻斷BMSCs向缺血腦組織遷移組遷移的細胞數為(1．13±0．37)×103，與正常對照組(2．38±0．62)×103比較有顯著差異(P ＜0．05)。

3 討論

已有大量動物實驗研究發現，BMSCs移植對于多種原因造成的中樞神經損傷具有促進損傷修復和改善神經功能的作用。在多種渠道的移植(損傷局部移植、靜脈內注射移植和腦室內移植等)研究［8-12］，均發現移植細胞有向損傷病灶聚集的趨勢，認為與損傷局部微環境促進移植細胞趨向遷移并有利于細胞在局部存活有關，但確切機制仍不明確。闡明其機制有助于采取積極手段促進移植BMSCs向損傷病灶的聚集，提高移植治療效果。趨化因子是一類由70～100個氨基酸組成小分子分泌蛋白，其基本功能就是對表達有相應趨化因子受體的細胞的定向趨化作用［21］。腦組織損傷后，神經元、神經膠質細胞、血管內皮細胞和免疫細胞在受到生長因子、干擾素等刺激誘導時可分泌出大量不同的趨化因子，BMSCs存在特定的趨化因子受體表達譜也已被大量的研究證實［22-23］。因此，趨化因子及其受體在BMSCs定向遷移中發揮的作用受到廣泛關注。

fractalkine是趨化因子CX3C亞家族的唯一成員，和其特異性受體CX3CR1相互作用，通過提高細胞粘附和促進CX3CR1陽性細胞的跨膜轉移在組織損傷中發揮作用［15-17］。fractalkine是為數不多的表達于腦組織中的趨化因子之一，主要表達于神經元，廣泛分布在中樞神經系統中。我們在前期研究中發現大鼠腦缺血再灌注損傷后，病變側腦皮質的中fractalkine mRNA表達增高，在缺血半球，可見大量fractalkine陽性細胞聚集在病灶周圍。靜脈移植的hMSCs能定向遷移到缺血再灌注損傷的大鼠腦組織中。定向遷移的hMSCs主要分布在fractalkine高表達的區域，干擾BMSCs上CX3CR1的表達，其向損傷腦組織的遷移能力明顯下降。以上結果說明fractalkine/CX3CR1在移植hMSCs向缺血損傷腦組織的定向遷移中發揮了重要作用。盡管上述研究發現fractalkine/CX3CR1系統與BMSCs向腦缺血病灶的定向遷移有關，但仍需要進一步的離體研究加以證實。

已有大量研究結果顯示體外培養的BMSCs存在特定的趨化因子受體表達譜［22-23］。本研究采用密度梯度離心貼壁篩選法分離純化BMSCs，運用realtime PCR和免疫組化技術分別從mRNA和蛋白水平觀察到fractalkine特異性受體CX3CR1在BMSCs的表達。本研究向Transwell小室內的無血清培養基加入fractalkine后遷移到聚碳酸酯膜底面BMSCs數量明顯增加，并且遷移細胞的數量與fractalkine濃度呈濃度依賴效應，這一結果表明fractalkine是一種可以趨化BMSCs定向遷移的細胞因子。利用Transwell體外趨化遷移模型也證實BMSCs具有向缺血再灌注損傷腦組織定向遷移的能力，再灌注3和7 d組腦組織萃取液誘導遷移的BMSCs顯著高于正常大鼠腦組織萃取液，結合我們前期研究所發現的再灌注損傷后3和7 d缺血區周圍腦組織fractalkine表達顯著增高，提示缺血前后fractalkine的表達變化可能與BMSCs遷移數目變化相關。進一步實驗中我們以CX3CR1抗體孵育BMSCs，實驗結果顯示封閉CX3CR1后，缺血腦組織萃取液誘導的BMSCs定向遷移受到影響(為正常對照組的47.5%)，這表明fractalkine/CX3CR1配體－受體作用促進BMSCs向缺血腦組織的定向遷移，但由于CX3CR1抗體不能完全阻斷缺血腦組織萃取液誘導的BMSCs定向遷移，所以可以推測還應有其他因子參與誘導BMSCs向腦缺血損傷區的定向遷移。

采用BMSCs進行移植治療，其資源豐富，可來源于自體，無組織異源性，無倫理限制，能穿過血腦屏障并向大腦組織遷移與腦組織整合，易于臨床廣泛應用，發展潛力巨大。本研究為 fractalkine/CX3CR1參與了BMSCs向損傷處遷移提供了充分的實驗數據，這為臨床應用靜脈注射BMSCs治療神經損傷性疾病提供了可能的治療方向。

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