骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療兔深靜脈血栓的實(shí)驗(yàn)研究

孔祥騫，孫 巖，金 星，董典寧，袁 海，周 華，吳學(xué)君

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一種多能干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的共性即自我更新及多向分化的能力，可分化成骨、軟骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基質(zhì)等中胚層組織［1-10］。自1968年Friedenstein等［11］發(fā)現(xiàn)BMSCs具有多向分化潛能以來，其便成為血管新生研究的熱點(diǎn)。下肢深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis，DVT)是一種臨床常見病、多發(fā)病，發(fā)病率達(dá)100/10萬，盡管采用抗凝、溶栓以及經(jīng)導(dǎo)管溶栓或手術(shù)取栓等多種方法治療，療效仍不理想，后期許多患者出現(xiàn)肢體疼痛腫脹、小腿潰瘍、行走困難等癥狀，患者承受巨大痛苦，給其家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)［12-13］。研究表明，血栓后遺癥的發(fā)生與血液回流是否通暢，即與血栓再通程度密切相關(guān)［14］。故而如何采用更為有效的治療方法促進(jìn)血栓的再通成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。鑒于干細(xì)胞的多能性，筆者所在科室設(shè)想通過將BMSCs移植到兔下腔靜脈血栓模型中，觀察其是否加速血栓的機(jī)化與再通，為DVT的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔40只，體重約2．5 kg，購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)兔場(chǎng)［許可證:SCXK(魯)2009-0001］。

1.2 主要試劑 胎牛血清、無血清培養(yǎng)液購自GIBCO公司;淋巴細(xì)胞分離液購自濟(jì)南科瑞公司;凝血酶購自蘇州新寶制藥有限公司;羊抗兔血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)-C單克隆抗體、鼠來源血管性血友病因子(vWF)多克隆抗體、鼠抗兔堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)多克隆抗體購自武漢博士德公司;青霉素購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司;山羊IgG二抗、驢IgG二抗購自廣州中杉公司;戊巴比妥鈉購自深圳市騰龍?jiān)磳?shí)業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:40只新西蘭大白兔中8只作為干細(xì)胞供體，余32只建立血栓模型，成功后隨機(jī)分為4組，每組8只。A組:建模3 d后，將含有107個(gè)BMSCs的DMEM懸液1 ml移植于股靜脈中;B組:建模3 d后，將1 ml 0．9%氯化鈉注射液注入股靜脈內(nèi);C組:建立血栓模型10 d后，將含有107個(gè)BMSCs的DMEM懸液1 ml移植于股靜脈中;D組:建立血栓模型10 d后，將1 ml 0．9%氯化鈉注射液注入股靜脈內(nèi)。

1.3.2 BMSCs的分離、體外培養(yǎng)及鑒定:8只干細(xì)胞供體大白兔采用2．5%戊巴比妥鈉以1 ml/kg劑量于兔耳緣靜脈麻醉后，用聚維酮碘消毒術(shù)區(qū)3遍，于兔股骨下端行骨髓穿刺，用10 ml注射器(預(yù)置25 U/ml肝素鹽水1 ml)抽取骨髓3～10 ml，可根據(jù)情況調(diào)整骨髓穿刺針的進(jìn)針深度和方向。將其加入肝素預(yù)凝的無菌離心管中，再加入等量無血清培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。將上述懸液小心加在等量1．073 g/ml的淋巴細(xì)胞分離液上，室溫下1000 r/min離心20 min，懸液分為4層，吸取中間的白膜層，用含血清的培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮，室溫下1000 r/min離心5 min，去上清，重復(fù)清洗2次，獲得較純凈的BMSCs。培養(yǎng)擴(kuò)增并進(jìn)行干細(xì)胞鑒定，首先鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的特性，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%后，制成單細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min。收集細(xì)胞沉淀，洗滌后分別加入熒光標(biāo)記的抗體。40℃孵育30 min，PBS洗滌，多聚甲醛固定后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原 CD11b、CD29、CD44、CD45 的表達(dá)［15］。

1.3.3 血栓模型的建立:4組大白兔麻醉成功后，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，嚴(yán)格無菌操作，于腹正中線做一長(zhǎng)約6 cm的縱向切口，保護(hù)腸管，游離顯露腎靜脈水平以下的下腔靜脈約1．5 cm，上下端以7#絲線結(jié)扎。將凝血酶配制成100 U/ml溶液，用1 ml注射器向結(jié)扎靜脈段內(nèi)注入10 U(0．1 ml)，觀察20～30 min，確認(rèn)血栓形成(血管由紅色變?yōu)榘导t色)后，遠(yuǎn)端拆除結(jié)扎線，近端將結(jié)扎線松開后再輕輕結(jié)扎，使近端下腔靜脈狹窄，防止血栓脫落，并作為取材標(biāo)記。檢查無異常后，縫合腹部切口。

1.3.4 BMSCs移植方法:麻醉成功后，于兔股部做一長(zhǎng)約1 cm的縱向切口，游離顯露股靜脈，穿刺靜脈注入1 ml BMSCs懸液，移植后按壓止血，依次縫合各層組織。

1.4 觀察項(xiàng)目

1.4.1 新生毛細(xì)血管形態(tài)觀察及計(jì)數(shù):移植后第14、28天，每組隨機(jī)取4只兔，過量麻醉處死，取病變段下腔靜脈，甲醛固定后做石蠟切片，行HE染色、vWF免疫組化檢查。鏡下計(jì)數(shù)每5個(gè)高倍視野新生毛細(xì)血管數(shù)，相同高倍視野下分別由3位檢驗(yàn)醫(yī)師計(jì)數(shù)，取平均值。

1.4.2 血栓中VEGF、bFGF蛋白表達(dá)的檢測(cè):移植后第14天，每組隨機(jī)取4只兔，過量麻醉處死，取下腔靜脈段血栓，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)血栓中VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)，以 β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為參照物。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析、q檢驗(yàn)，α=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 新生毛細(xì)血管形態(tài)觀察及計(jì)數(shù)比較 移植后對(duì)兔石蠟切片行HE染色可見新生毛細(xì)血管內(nèi)紅細(xì)胞被染成紅色，vWF免疫組化染色可見新生毛細(xì)血管壁呈棕褐色，據(jù)此可以觀察新生毛細(xì)血管。A、C組移植后14 d可見有新生毛細(xì)血管形成，以C組更明顯;移植后28 d，4組均見有新生毛細(xì)血管生成，A、C組新生血管腔隙較B、D組明顯增大。A組鏡下可見較多棕褐色新生毛細(xì)血管，但管腔較小，血栓機(jī)化再通較明顯;C組可見大量新生毛細(xì)血管，且管腔大，血栓機(jī)化再通明顯;B、D組鏡下可見少量新生毛細(xì)血管，管腔變化不明顯，且新生血管多集中在血栓周邊，靠近管壁。A、B、C、D組移植后14 d每5個(gè)高倍視野新生毛細(xì)管數(shù)分別為(78．57±10．64)、(43．57 ± 5．38)、(94．00 ± 7．67)、(58．53 ± 6．87)條，移植后28 d 分別為(118．00 ±12．53)、(66．32 ±4．65)、(138．00 ± 12．69)、(74．23 ± 8．38)條，A、C組多于B、D組(P＜0．05)，C組多于 A組(P＜0.05)，B組與D組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 VEGF、bFGF蛋白的表達(dá) Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，各組 VEGF、bFGF蛋白均有表達(dá)，A組VEGF、bFGF蛋白水平高于 B 組(P＜0．05)，C 組VEGF、bFGF蛋白水平高于 D 組(P ＜0．05)，B、D 兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，見圖1、2和表1。

3 討論

DVT是一種常見靜脈疾病，不僅可引發(fā)肺栓塞，而且疾病后期可并發(fā)下肢慢性靜脈功能不全(CVI)，表現(xiàn)為肢體腫脹、疼痛、潰瘍形成等癥狀。30% ～67%髂、股靜脈內(nèi)存在大量血栓的患者，病后3～8年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的CVI癥狀，而且未徹底治愈的DVT并發(fā)CVI患者的臨床癥狀要比單純靜脈瓣膜功能不全患者表現(xiàn)出的倒流性疾病癥狀更加嚴(yán)重［16］。

血栓后遺癥的發(fā)生與血液回流是否通暢即血栓再通程度有密切關(guān)系。血栓的機(jī)化和再通是由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的動(dòng)態(tài)過程。盡管目前已經(jīng)進(jìn)行了長(zhǎng)期大量的基礎(chǔ)及臨床研究［17-20］，血栓機(jī)化和再通的具體機(jī)制仍未完全闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)BMSCs在血栓機(jī)化再通過程中發(fā)揮著重要的作用。Mizuno等［21］用一個(gè)不透膜把栓子和血管壁隔開，一定時(shí)間后血栓內(nèi)的裂隙仍可見內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，機(jī)化同樣會(huì)發(fā)生。Feigl等［22］用可滲透膜包裹血栓后放入血管中，防止其與血管壁接觸，血栓內(nèi)部同樣會(huì)發(fā)生內(nèi)皮化和再通。以上實(shí)驗(yàn)從側(cè)面說明血栓中再通管道的內(nèi)皮細(xì)胞不只來自血管壁，還可能來自循環(huán)血液中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)。Moldovan［23］對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在靜脈血栓再通中的作用進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)增加單核細(xì)胞或EPCs能夠加速血栓再通。

圖1 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后第14天各組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)

圖2 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后第14天堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白的表達(dá)

表1 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后第14天各組VEGF、bFGF光密度相對(duì)于β-actin的比值(±s)

表1 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后第14天各組VEGF、bFGF光密度相對(duì)于β-actin的比值(±s)

注:VEGF:血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，bFGF:堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，β-actin:β-肌動(dòng)蛋白;A、C組:分別于建模3、10 d后移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;B、D組:分別于建模3、10 d后注射0．9%氯化鈉注射液;與B組比較，a P＜0．05;與D組比較，c P ＜0．05

組別 兔數(shù)VEGF bFGF A 組 4 0．701 ±0．082a 0．413 ±0．032 a 4 0．613 ±0．079 0．351 ±0．061 B 組 4 0．543 ±0．069 0．295 ±0．053 C 組 4 1．032 ±0．107c 0．543 ±0．046c D組

BMSCs具有強(qiáng)大的自我復(fù)制能力，可分化為神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血細(xì)胞等多種細(xì)胞，并且能夠分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)血管新生［24］。鑒于BMSCs的多分化潛能，本研究將經(jīng)體外培養(yǎng)并鑒定成功的BMSCs移植到下腔靜脈血栓模型中，觀察血栓內(nèi)新生血管生成情況，探討其可能機(jī)制。發(fā)現(xiàn)BMSCs移植組(A、C組)新生毛細(xì)血管數(shù)明顯多于0．9%氯化鈉注射液對(duì)照組(B、D組)，移植后28 d效果更明顯;而在移植時(shí)間的選擇上，建模后10 d(C組)移植效果比建模后3 d(A組)好，其原因可能是在建模早期局部炎性反應(yīng)較重，炎性因子較多，引起B(yǎng)MSCs凋亡，使新生血管不如后期明顯。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)BMSCs組血栓內(nèi)VEGF、bFGF蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，高于0.9%氯化鈉注射液組。表明BMSCs移植可以改變血栓的微環(huán)境，在促進(jìn)新生血管形成的同時(shí)，還可增加VEGF、bFGF的表達(dá)。

分析以上結(jié)果，筆者推測(cè)BMSCs促進(jìn)血栓再通可能與以下機(jī)制有關(guān):①BMSCs分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生。如前所述，BMSCs具有分化成早期中胚層和外胚層各種細(xì)胞的潛能［25］。已有研究者在體外成功將BMSCs誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞［26］，亦有研究發(fā)現(xiàn)BMSCs移植可以治療缺血性心臟病，其機(jī)制是缺血心肌組織刺激BMSCs分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，單個(gè)或多個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞形成管樣結(jié)構(gòu)，形成新生血管［24］。②BMSCs分泌多種血管生長(zhǎng)因子改善血栓微環(huán)境，促進(jìn)血管新生。已有研究證實(shí)，BMSCs可以分泌 VEGF、bFGF、胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)、促血管生成素-1(Ang-1)等多種血管生長(zhǎng)因子［27］。同時(shí)有研究表明，在血管新生的早期，bFGF對(duì)微血管新生有促進(jìn)作用，而VEGF主要在促血管新生后期發(fā)揮持續(xù)作用［28］。另外，BMSCs還可以通過釋放VEGF、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等引起循環(huán)中的干細(xì)胞歸巢，促進(jìn)血管新生和組織修復(fù)［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植組較0.9%氯化鈉注射液對(duì)照組血栓組織中VEGF、bFGF表達(dá)明顯增強(qiáng)，說明BMSCs分泌的VEGF、bFGF在促血管新生中起重要作用。③BMSCs促進(jìn)側(cè)支血管的形成。BMSCs可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，直接參與側(cè)支血管結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，同時(shí)還可以通過分泌多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、化學(xué)遞質(zhì)等促進(jìn)骨髓源性的EPCs聚集和活化，通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞凋亡等方式促進(jìn)側(cè)支血管的形成和塑形［29］。側(cè)支血管數(shù)量的增加和管徑的增粗對(duì)于建立有功能的側(cè)支循環(huán)網(wǎng)絡(luò)、促進(jìn)血液回流具有重要意義。

目前BMSCs被廣泛應(yīng)用于各系統(tǒng)疾病的治療，而用于DVT少有報(bào)道。本研究在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，BMSCs能夠改變血栓的微環(huán)境，促進(jìn)血栓的機(jī)化和再通，為下一步臨床應(yīng)用BMSCs移植治療人下肢DVT打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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