血管內皮生長因子在模擬高原缺氧小鼠腦組織、心肌組織中的表達研究

高榮敏，馬慧萍，李 倩，李 琳，賈正平

高原缺氧對高原人群的身體健康危害極大，影響機體各種氧化代謝，最終導致心、腦等重要臟器因供氧不足而產生高原腦水腫、高原性心臟病等急性高原病(acute mountain sickness，AMS)，而這些疾病的始動因子是內皮細胞的紊亂。大量研究表明內皮細胞間是有緊密連接的，大血管中動脈的內皮細胞連接緊密，靜脈的則較弱，細胞間的連接通過復雜的黏附結構組成，如縫隙連接蛋白等，缺氧時縫隙連接蛋白重分布，致使血管通透性發生了改變［1］。

內皮細胞分泌的血管內皮生長因子(VEGF)有強效提高血管通透性的作用，比組織胺強5000倍［2］，還能促進內皮細胞增生，誘發新血管形成。由于VEGF具有誘導血管發生的潛能和對內皮細胞的特異性，被認為是主要的血管發生蛋白。本文旨在探討VEGF在模擬高原缺氧小鼠模型腦及心肌組織中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性BALB/c小鼠，體重18～22 g，7周，購自蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科，生產許可證編號:SYXK(軍)2012-0020，飼養于蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科，實驗期間提供足夠的食物和水，小鼠正常飲食。

1.2 儀器與試劑 FLYDWC50-ⅡA型低壓低氧動物實驗艙(中航工業貴州雷航空軍械有限責任公司);高速離心機(德國Appendorf公司);水浴鍋(上海醫療器械七廠);隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠);TB-718E型生物組織自動包埋機(湖北泰雅電子技術有限公司);冷凍切片機、ZT-12J1生物組織自動脫水機、生物組織攤烤片機均購于湖北省孝感市亞光醫用電子技術有限公司;多抗Rabbit polyclonalto VEGF ab46154，購于 abcam;抗體稀釋液購自武漢博士得生物工程有限公司;SABC免疫組化試劑盒(SA1022兔IgG-1/2KIT，武漢博士得生物工程有限公司);DAB顯色液(武漢博士得生物工程有限公司);PBS磷酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液均購于北京中山金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模擬海拔8000 m急性高原缺氧實驗:取SPF級健康雄性BALB/c小鼠70只，飼養適應3 d后隨機分成正常對照組，缺氧6 h組、9 h組、12 h組、24 h組、2 d組、3 d組，每組10只。正常對照組小鼠不缺氧，將其余各組小鼠放入低壓低氧動物實驗艙模擬8000 m海拔缺氧環境。減壓時以10 m/s的速度升至8000 m海拔，維持各組缺氧時間，完成減壓缺氧后于10 min內快速放氣使艙內氣壓與外界大氣壓相同。小鼠完成減壓后立即脫臼處死，并根據不同實驗目的對大腦和心臟進行相應處理。

1.3.2 腦組織和心肌組織病理觀察:取各組小鼠的腦組織標本和心肌組織標本，生理鹽水洗凈血液后立即浸入10%甲醛中浸泡。樣品送至蘭州軍區蘭州總醫院病理科，進行石蠟包埋、組織切片、染色以及觀察。

1.3.3 腦和心肌組織VEGF的表達水平:應用免疫組化檢測模擬高原缺氧小鼠腦和心肌組織VEGF的表達水平，操作如下:①分別取各組小鼠的腦組織海馬區標本及心肌組織標本，石蠟切片放至烘箱;②脫蠟至水;③3%H2O2滅活內源性酶;④熱修復抗原;⑤滴加BSA封閉液;⑥滴加一抗，濃度稀釋一抗1∶150;⑦滴加二抗;⑧滴加SABC;⑨DAB顯色(顯色劑現用現配)，鏡下控制反應時間;⑩蘇木素輕度復染，封化。

每張切片隨機選取3個200倍視野，背景為紫藍色，VEGF在胞質表達，陽性胞核呈藍色，胞質著棕黃色，顏色深淺和著色強弱表明VEGF表達水平的高低。參照 Hayashi等［3］標準，對 VEGF陽性表達強度行半定量評分，并按下列標準判斷:細胞未著色:0分;散在細胞著色(淺黃色):1分;彌漫性弱陽性著色(淺棕黃色):2分;彌漫性中等強度著色(棕黃色):3分;彌漫性強陽性著色(棕褐色):4分。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，各組實驗數據用均數±標準差(±s)表示，應用t檢驗進行統計學處理。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 腦組織病理結構觀察 如圖1所示，光鏡下正常對照組腦組織細胞形態完好，結構正常，血管清晰可見;缺氧6 h組與正常對照組比較，腦組織細胞核染色質不均勻，呈空泡狀或網狀，腦組織間質內空泡狀結構增多，血管周、神經細胞周和膠質細胞周間隙擴大;缺氧9 h組較缺氧6 h組稍加重，缺氧12 h組和缺氧24 h組形態學變化最為顯著，細胞核染色質極度不均勻呈空泡狀或網狀，間質內空泡狀結構數量明顯增多且變大，血管周、神經細胞和膠質細胞周間隙明顯擴大;缺氧2 d組和缺氧3 d組較缺氧24 h組形態學變化較緩和。

2.2 心肌組織顯微結構觀察 如圖2所示，光鏡下正常對照組心肌細胞形態結構完好，組織結構正常;與正常對照組相比，缺氧6 h組可見肌組織充血，血管輕度擴張，部分細胞輕度腫脹，橫紋消失，結構不清呈均質狀，少量肌細胞核固縮深染;缺氧9 h組較缺氧6 h組以上形態學變化較明顯;缺氧12 h組和缺氧24 h組較缺氧9 h組肌纖維呈均質狀及核固縮不明顯;缺氧2 d組和缺氧3 d組偶見肌纖維呈均質狀及核固縮。

2.3 腦組織中VEGF蛋白的表達 與正常對照組相比，缺氧各組腦組織胞質著色深，細胞陽性數量多，著色面積大。見圖3。對各組腦組織VEGF陽性表達強度行半定量評分，缺氧各組與正常對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

圖1 7組小鼠腦組織病理切片(HE×200)

圖2 7組小鼠心肌組織病理切片(HE×200)

圖3 7組小鼠腦組織血管內皮生長因子蛋白表達(HE×200)

2.4 心肌組織中VEGF蛋白的表達 與正常對照組比較，缺氧各組心肌組織胞質著色深，著色面積大，見圖4。對各組心肌組織VEGF陽性表達強度行半定量評分，缺氧各組與正常對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

圖4 7組小鼠心肌組織血管內皮生長因子蛋白表達(HE×200)

表1 7組小鼠腦、心肌組織VEGF陽性表達強度半定量評分(±s)

表1 7組小鼠腦、心肌組織VEGF陽性表達強度半定量評分(±s)

注:與正常對照組比較，b P＜0.01

分組 鼠數 腦組織 心肌組織缺氧6 h組 10 2.4±0.8b 2.6±0.5 b缺氧9 h組 10 3.2±0.6b 3.4±0.7b缺氧12 h組 10 3.4±0.7b 3.5±0.5b缺氧24 h組 10 3.6±0.5b 3.7±0.5b缺氧2 d組 10 3.7±0.7b 3.7±0.7b缺氧3 d組 10 3.8±0.4b 3.8±0.4b正常對照組10 0.6±0.1 0.3±0.1

3 討論

高原低氧環境嚴重損害腦、心、肺等對氧敏感的組織器官，易導致高原性心肌肥厚、高原腦水腫等。機體缺氧后，作為代償機制，易導致血管增生，VEGF是促血管增生，增加血管通透性的關鍵因子［4］。本實驗通過模擬高原缺氧環境，研究腦和心肌組織的形態學變化，并從蛋白水平研究VEGF的變化。

本研究發現，缺氧6 h組腦組織細胞核染色質不均勻，呈空泡狀或網狀，腦組織間質內空泡狀結構增多，血管周、神經細胞周和膠質細胞周間隙擴大;缺氧9 h組較缺氧6 h組稍加重，缺氧12 h組和缺氧24 h以上形態學變化最為顯著，缺氧2 d組和缺氧3 d組較缺氧24 h組以上形態學變化逐漸緩和。缺氧6 h組可見心肌組織輕度血管擴張充血，部分細胞輕度腫脹，橫紋消失結構不清呈均質狀，少量肌細胞核固縮深染;缺氧9 h組較缺氧6 h組以上形態學變化較明顯;缺氧12 h組和缺氧24 h組較缺氧9 h組肌纖維呈均質狀及核固縮不明顯;2 d組和3 d組偶見肌纖維呈均質狀及核固縮。本實驗結果表明缺氧會造成小鼠腦和心肌組織呈現病理性損傷，有水腫現象，且損傷程度與缺氧時間有關。

血管內皮生長因子蛋白(VEGFs)是作用于血管內皮細胞(EC)的一種主要蛋白質，以游離形式廣泛存在于機體各組織、器官，與其特異性受體構成VEGF/VEGFR系統共同參與脈管內皮細胞生理或病理狀態下的通透性變化、內皮細胞的生長、存活和增殖、再生神經元及血管重建［5-6］。冠狀血管形成需要多種信號分子及相關通路，通過代謝或應激因素激活，缺氧會刺激缺氧誘導因子(HIF)、VEGF及其他因子的表達。一個部分血管叢穿透主動脈，主要由VEGF誘導，形成冠狀動脈口，它提供了解剖襯底的冠狀流，早期的增長的冠狀脈管系統由一個管狀網絡形成［7］。在缺氧-局部缺血狀態下，低氧誘導的轉錄因子起到關鍵作用，如HIF及下游的VEGF、促紅細生成素等VEGF能促進毛細血管增生［8-10］。VEGF 表達受到炎癥、缺氧等因素調節［11］。Zhu等［12］發現在大腦缺血缺氧狀態下，VEGF能刺激神經膠質細胞、神經生長因子的增生，從而抑制神經細胞死亡。VEGF-A通過促血管生成因子MMP-9(間質金屬蛋白酶)傳遞給中性粒細胞，從而誘導移植缺氧組織的血管生成［13］。Buroker等［14］研究發現VEGF-A核苷酸多態性及其轉錄因子結合部位與急性高原病有關。Hongge等［15］研究發現短耳野兔在高海拔地區VEGF189和VEGF165的表達會增加，并且海拔越高，增加越多。另有研究發現，將兔子中腦動脈閉塞2 h后，注入VEGF能減輕腦梗死及腦缺血缺氧狀態，并在一定濃度內呈劑量依賴性［16］。Nural-Guvener等研究發現充血性心力衰竭后的大腦皮層和海馬區的VEGF表達增加。神經炎癥發生在心肌梗死之后，此外，慢性充血性心力衰竭誘導的缺氧可能會上調VEGF的表達［17］，有研究表明P13K/Akt通路能夠調節血管生成相關因子一氧化氮(NO)及抗血管生成因子的表達［18］，由 VEGF介導的信號途徑可能是通過P13K/Akt通路，抑制細胞凋亡蛋白酶、鉀電流及增加了神經細胞的增生有關［19］。VEGF信號機制對生理狀態和病理狀態下的血管的新生的產生有著重要的影響，另有研究VEGF在不同條件下對組織物質代謝的影響，從而為血管增生尋找新的靶點［20］。本實驗結果證明，缺氧小鼠腦和心肌組織中VEGF的表達升高，且隨缺氧時間的延長，表達顯著增加。

綜上所述，缺氧能造成小鼠腦和心肌組織損傷，呈現水腫的病理表現，并刺激VEGF分泌，導致新生血管形成。一方面，作為缺氧狀態下機體的代償機制，VEGF會增加;另一方面，VEGF能影響血腦屏障，其表達增加會導致血管通透性增加，血管內液外滲，導致組織呈現水腫的病理性變化。VEGF適量升高，誘發新血管形成而不會引起腦、心等器官的病理變化，有利于提高機體對高原缺氧的適應能力。因此，我們有望在VEGF因子上作進一步研究，通過干擾VEGF，使其適量表達，從而應用其治療高原腦水腫、高原性心肌損傷等疾病。

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