馬來酸依那普利葉酸對H型高血壓大鼠血管平滑肌細胞GRP94和caspase-12的表達影響

盧 凡，趙連友，張志敏，鄒 青，玉小路，衛聰穎，李 雪，丁 璐

伴有高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血癥的原發性高血壓為H型高血壓［1］。我國成年高血壓患者伴有高 Hcy血癥者約占75．5%［2］。Graham等［3］證實，H型高血壓患者心血管事件發生率較單純存在高血壓的患者高出約5倍，較正常人高出約25～30倍，還確證H型高血壓患者的兩種危險因素高血壓和高Hcy血癥在導致心腦血管事件上存在明顯的協同作用。以往研究發現，在高血壓初期，可以引起血管平滑肌細胞內質網應激反應(endoplasmic reticulum stress，ERS)，使內質網應激相關因子葡萄糖調節蛋白94(GRP94)和半胱氨酸門冬氨酸特異性蛋白酶12(caspase-12)等的表達增加，導致內質網的內穩態失衡，血管平滑肌細胞肥大凋亡，血管壁增厚，最終引起動脈血管的重構。近年來發現，高Hcy也可促進平滑肌細胞的增殖和分化，使血管內膜中層增厚［4］，但其是否可以通過內質網應激途徑加重高血壓血管重構，有待進一步研究。馬來酸依那普利葉酸片是全球第一個批準用于治療Hcy

升高和伴有Hcy升高高血壓的藥物［5］，但其發揮功能的具體分子機制目前尚未見相關的文獻報道。本研究通過建造H型高血壓大鼠模型，觀察ERS相關因子GRP94和caspase-12表達的變化，并探討馬來酸依那普利葉酸片對H型高血壓大鼠血管重構的抑制作用，旨在為H型高血壓所致的血管重構提供理論依據，為馬來酸依那普利葉酸片的臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料 成年自發性高血壓(SHR)大鼠，雄性，36只，體質量200～240 g，鼠齡8～10周(第四軍醫大學動物實驗中心提供)。兔抗大鼠GRP94抗體及兔抗大鼠caspase-12抗體(美國Abcam公司)，堿性磷酸酶(AP)標記的羊抗兔IgG(美國Santacruz公司)。蛋氨酸(Sigma公司)，馬來酸依那普利葉酸片、Hcy檢測試劑盒及AUSA 340ⅡHcy檢測儀(深圳奧康制藥有限公司)。濃縮型二氨聯苯胺(DAB)檢測試劑盒(上海研晶生物科技有限公司)。BX41型光學顯微鏡及DP71型顯微攝像系統(日本奧林巴斯株式會社)，Image ProPlus 6．0圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)，RM6280型多道智能生理記錄及分析處理系統(成都儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組:將36只SHR大鼠隨機分3組，每組12只。依葉片組給予含2%蛋氨酸顆粒的飼料喂養同時給予馬來酸依那普利葉酸片粉劑20 mg/(kg·d)雙蒸水灌胃。對照組給予普通飼料喂養同時給予等量雙蒸水灌胃，蛋氨酸組給予含2%蛋氨酸顆粒的飼料喂養同時給予等量雙蒸水灌胃。

1.2.2 血清Hcy濃度的測定:8周后抽取下腔靜脈血2 ml，室溫下靜置30 min，3000 r/min離心10 min后取上清液，存于EP管后置于－80℃冰箱保存待測。集中測定前將標本置于冷水中復溶，AP90Hcy檢測試劑盒恢復至室溫，按Hcy檢測試劑盒(速率法)說明書進行操作。

1.2.3 平均動脈壓(MAP)的測量及標本的采集:稱量大鼠體質量、腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液(0.2 ml/50 g)使其麻醉，將麻醉好的大鼠于仰臥位固定于鼠臺，頸部剪毛，酒精、碘酒消毒處理，于頸前正中切口，分離出右側頸總動脈后結扎其遠端，并在血管壁上向心做“V”型切口，將內充1%肝素生理鹽水的測壓導管插入至升主動脈。穩定10 min后，記錄其動脈收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP)。MAP=［DBP+1/3(SBP-DBP)］。記錄血壓后，快速開胸，切取長度約1.0 cm的胸主動脈，PBS沖洗，以多聚甲醛(40 g/L)固定，石蠟包埋。

1.2.4 主動脈中層厚度的測量:每個胸主動脈石蠟切片各選取5張，每張切片隨機選取3個視野，利用Image-proplus 6.0醫學圖像分析系統測量大鼠主動脈中層的厚度，取其平均值。

1.2.5 主動脈血管平滑肌細胞中GRP94和caspase-12的表達:留取標本切片(片厚5μm)，進行免疫組化染色檢測。①GRP94檢測主要步驟:石蠟切片常規脫蠟至水，加3%H2O2處理10 min，在微波爐中用枸櫞酸鹽緩沖液(0.01 mol/L、pH 6.0)熱修復組織抗原15 min，冷卻后用PBS洗滌。滴加5%的BSA封閉液室溫20 min封閉后，依次分別滴加1∶100小鼠抗大鼠GRP94抗體(4℃過夜，PBS洗滌)、生物素化羊抗兔IgG(37℃孵育30 min，PBS洗滌)及 SABC(37℃孵育20 min，PBS洗滌)。加DAB顯色后，再滴加蘇木素輕度復染，依次經脫水、透明、封片后，于顯微鏡下觀察結果。②caspase-12檢測同上。

2 結果

2.1 血清Hcy值比較 喂養8周后，蛋氨酸組Hcy水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.01);依葉片組的Hcy水平明顯降低，與蛋氨酸組比較差異有統計學意義(P＜0．01)。見表1。

2.2 MAP的比較 喂養8周后，蛋氨酸組和對照組的MAP比較無顯著差異(P＞0．05);依葉片干預后大鼠MAP明顯降低，與蛋氨酸組相比較，差異顯著(P ＜0．05)。見表1。

2.3 主動脈中層厚度比較 喂養8周后，蛋氨酸組與對照組相比，動脈中層厚度增加，兩者之間有明顯的差異(P＜0．05);用依葉片干預以后，與蛋氨酸組比較，動脈中層厚度降低，差異顯著(P＜0．05)。見表1。

2.4 各組大鼠主動脈平滑肌細胞中GRP94免疫組化的表達的變化 GRP94表達主要位于胞質中，染色成棕黃色顆粒。蛋氨酸組大鼠血管平滑肌細胞CRP94表達較對照組增高更為顯著(P＜0．05);用依葉片干預后，與蛋氨酸組比較CRP94表達水平明顯減低(P ＜0．05)。見圖1、表2。

圖1 3組大鼠血管平滑肌中GRP94的免疫組化檢測(DAB×400)

表1 3組大鼠平均動脈壓、同型半胱氨酸、主動脈中層厚度的比較(±s)

表1 3組大鼠平均動脈壓、同型半胱氨酸、主動脈中層厚度的比較(±s)

注:對照組給予普通飼料喂養同時給予雙蒸水灌胃，蛋氨酸組給予含2%蛋氨酸顆粒的飼料喂養同時給予雙蒸水灌胃，依葉片組給予含2%蛋氨酸顆粒的飼料喂養同時給予馬來酸依那普利葉酸片粉劑20 mg/(kg·d)雙蒸水灌胃。與對照組比較，a P ＜0．05，b P ＜0．01;與蛋氨酸組比較，c P ＜0．05，d P ＜0．01

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2.5 各組大鼠主動脈平滑肌細胞中caspase-12免疫組化的表達的變化 caspase-12表達主要位于胞質中，染色成棕黃色顆粒。蛋氨酸組與對照組相比caspase-12蛋白的表達量顯著增加(P＜0．05);依葉片干預后，與蛋氨酸組比較caspase-12蛋白表達水平顯著降低(P＜0．05)。見圖2、表2。

圖2 3組大鼠血管平滑肌中caspase-12的免疫組化檢測(DAB×400)

表2 3組大鼠血管平滑肌細胞中GRP94、caspase-12的表達變化(±s)

表2 3組大鼠血管平滑肌細胞中GRP94、caspase-12的表達變化(±s)

注:對照組給予普通飼料喂養同時給予雙蒸水灌胃，蛋氨酸組給予含2%蛋氨酸顆粒的飼料喂養同時給予雙蒸水灌胃，依葉片組給予含2%蛋氨酸顆粒的飼料喂養同時給予馬來酸依那普利葉酸片粉劑20 mg/(kg·d)雙蒸水灌胃。與對照組比較，a P ＜0．05;與蛋氨酸比較，c P ＜0．05

組別 只數GRP94 caspase-12對照組12 0．49 ±0．008 0．51 ±0．012蛋氨酸組 12 0．71 ±0．021a 0．73 ±0．019a依葉片組 12 0．32 ±0．015c 0．38 ±0．009 c

3 討論

Hcy是一種含硫氨基酸，是人體蛋氨酸的中間代謝產物。我國是一個高血壓大國，高血壓人口接近2億，其中3/4的高血壓患者伴有高Hcy血癥。大量研究證實［6］，高血壓和血漿Hcy水平升高在導致心腦血管事件上具有協同作用，使心血管疾病死亡危險性增加4～6倍。血漿Hcy與高血壓血管重構之間有何關系，目前尚不清楚。因此，血漿Hcy與高血壓的關系已經成為目前研究的熱點課題。本研究通過建立高Hcy高血壓大鼠模型，探討了Hcy對高血壓大鼠血管主動脈血管平滑肌細胞ERS分子伴侶GRP94、caspase-12表達變化，動脈中層厚度及對血管重構的影響。

Baumbac等［7-8］報道高Hcy血癥可引起高血壓血管內皮功能損傷加重、血管平滑肌細胞肥大增生明顯及加重血管的重構;Tyagi［9］曾報道，Hcy能明顯刺激高血壓血管平滑肌細胞肥大增殖，加速血管重構。本實驗通過用含2%蛋氨酸飼料喂養SHR大鼠，成功建立高血壓伴高Hcy血癥大鼠模型，血清Hcy濃度可高達86μmol/L。研究顯示，蛋氨酸組與對照組相比，兩組MAP均＞160 mmHg，兩組比較差異無統計學意義;蛋氨酸組血清Hcy濃度水平比對照組顯著升高，差異明顯;蛋氨酸組與對照組相比主動脈中層厚度顯著增加。提示高Hcy能加重動脈血管增厚，從而加重高血壓引起的血管重構，與上述報道一致。

內質網應激(ERS)途徑是新近發現的一條細胞凋亡信號傳導通路;近來研究發現［10-11］，參與了多種病理及生理過程，與心血管疾病的關系極為密切。ERS初期引起血管動脈平滑肌細胞中ER分子伴侶GRP78、GRP94等上調，促進未折疊或錯誤折疊的蛋白降解來緩解內質網壓力［12］，維持細胞狀態的穩態［13］，起到保護細胞的作用。但是過強或者長時間的ERS，超過細胞自身的調節能力，反而激活促凋亡因子caspase-12、CHOP/GADD153等表達，引起細胞代謝紊亂［14-15］，最終導致細胞凋亡［16］。高血壓通過ERS途徑參與了血管重構的發生發展。是否高Hcy也對血管平滑肌細胞ERS途徑產生影響，鮮有文獻報道。本研究結果顯示，蛋氨酸組 GRP94和caspase-12的表達量明顯增加，說明Hcy參與了動脈血管平滑肌ERS過程;蛋氨酸組與對照組比較GRP94和caspase-12的表達量更加顯著，說明Hcy和高血壓的雙重因素對血管平滑肌的損傷作用顯著大于單純高血壓對血管的損傷;Hcy可以加重高血壓血管平滑肌的損傷，導致血管重構的加重。ERS可能為H型高血壓雙因素(高Hcy和高血壓)協同作用的分子機制。

馬來酸依那普利葉酸片是我國自主研發的復方制劑，馬來酸依那普利片是一種血管緊張素轉換酶抑制劑，具有良好的降壓效果;葉酸屬于B族維生素，能夠促進Hcy甲基化，降低血漿Hcy;兩者合用在降壓的同時明顯降低Hcy濃度，對于H型高血壓具有雙重治療作用。研究發現，固定配方中高葉酸劑量組較自由聯合方案中高葉酸劑量組降低Hcy相對有效率提高10%，降壓或降Hcy相對有效率提高22%［17］。本實驗中，依葉片組與蛋氨酸組相比較，不僅降低了Hcy濃度和MAP，同時也使GRP94和caspase-12表達顯著降低，使血管壁中層增厚顯著降低，表明依葉片可能通過抑制H型高血壓血管平滑肌ERS途徑來逆轉血管重構。

綜上所述，Hcy可能通過ERS途徑參與并加重高血壓引起的血管平滑肌重構的過程。依葉片雙重治療作用使得高血壓及Hcy得到有效控制，可能通過抑制內質應激來保護血管平滑肌細胞，改善血管重構。但是否還有其他信號分子、信號通路參與有待進一步研究。本實驗為馬來酸依那普利片治療H型高血壓提供了臨床應用的理論依據。

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