不同潮氣量、通氣時間對家兔呼吸機相關肺損傷模型的影響

張群英，豐浩榮，葛 偉，許鵬程

呼吸機所致肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)是機械通氣引起或者加重的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，常導致患者肺部原有病情加重甚至引發肺外多系統器官功能衰竭(MSOF)而死亡。目前，VILI的發病機理不清，早期診斷困難，治療缺少針對性，確診時常喪失救治時機，病死率居高不下［1］。動物實驗是研究VILI的重要方法，本研究采用不同的潮氣量(VT)和通氣時間，來制作家兔VILI模型，為進一步研究VILI發病機制及其防治措施奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 體重2．2～2．9 kg成年雄性清潔級家兔54只，徐州醫學院實驗動物中心提供，動物許可證號:SYXK(蘇)2003-0003。

1.2 實驗設備與主要試劑 小動物呼吸機(浙江醫科大學儀器實驗廠，DH-150型)，生物機能實驗系統(成都泰盟科技公司，BL-420型)，血氣分析儀(瑞氏AVL公司，compact 3型)，電熱恒溫干燥箱(上海精宏設備有限公司，DHG-9037型)，戊巴比妥鈉(上海拜力生物科技公司)，哌庫溴胺(成都諾迪康生物制藥公司)，考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 方法

1.3.1 動物準備:耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉全身麻醉，備皮行氣管切開置入氣管插管，連接呼吸機行機械通氣，間斷給予哌庫溴胺維持肌松。分離左側頸總動脈，插入動脈導管連接生理監護儀，持續監測血壓、心率并進行動脈血采集。分離右側頸靜脈置入靜脈套管針用作靜脈通道，以10 ml/(kg·h)速度持續輸注生理鹽水，補充丟失的液體并維持血壓穩定。通氣參數設置為容量控制(CMV):VT 10 ml/kg，吸入氧濃度(FiO2)21%，吸呼比(I∶E)1∶2，呼氣末正壓(PEEP)2 cmH2O(1 cmH2O=0．098 kPa)，呼吸頻率30～40/min，維持二氧化碳分壓(PaCO2)40 mmHg(1 mmHg=0．133 kPa)。

1.3.2 動物分組:機械通氣穩定30 min后記錄各項生理參數，為基礎值(時間點記為0 h)，將動物隨機分為各實驗組，予以不同VT和通氣時間，每亞組均為6只家兔。①小潮氣量組(VT10組):繼續初始通氣條件機械通氣，調節VT為10 ml/kg，呼吸頻率32/min，通氣時間分別為2 h，4 h，6 h(分別記為VT10-2亞組，VT10-4亞組，VT10-6亞組)。②中潮氣量組(VT20組):調節VT為20 ml/kg，呼吸頻率14/min，通氣時間分別為 2 h，4 h，6 h(分別記為VT20-2亞組，VT20-4亞組，VT20-6亞組)。③大潮氣量組(VT40組):調節VT為40 ml/kg，呼吸頻率8/min，通氣時間分別為 2 h，4 h，6 h(分別記為VT40-2亞組，VT40-4亞組，VT40-6亞組)。通氣過程中根據血氣情況調整呼吸頻率以維持PaCO240 mmHg左右，除PEEP設為0 cmH2O外，余通氣參數與準備階段相同。

1.4 檢測指標 ①血流動力學:連續監測平均動脈血壓(MAP)、心率(HR)。②血氣分析:每間隔2 h測定氧分壓(PaO2)、PaCO2、pH值等氣體交換和代謝指標。③呼吸力學:連續監測氣道峰壓(Ppeak)、平臺壓(Pplat)。實驗終點放血處死動物(未到終點時間即死亡的出組)。④BALF蛋白定量、有核細胞及中性粒細胞計數:開胸后以動脈夾夾閉右主支氣管，以8 ml 4℃生理鹽水反復肺灌洗3次回收，再用8 ml生理鹽水灌洗一次回收，將兩次回收得到的BALF用雙層無菌紗布過濾，4000 r/min離心15 min。細胞沉渣重新懸浮于1 ml生理鹽水，計數有核細胞總數，并涂片瑞氏染色計數中性粒細胞。上清液以考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。⑤肺組織濕干比:選取左肺上葉稱濕重，置于80℃烤箱烘烤24 h稱干重，計算濕干比。⑥病理形態學觀察:留取左肺下葉組織適量，置入4%多聚甲醛溶液固定，常規包埋石蠟切片，HE染色光鏡下觀察肺損傷情況。

1.5 統計學處理 采用SPSS 11．5軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差(±s)表示，Bartlett檢驗進行方差齊性檢驗，方差分析中Dunnett方法進行組間均數比較，α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 臨床表現及死亡率 各組動物在麻醉后，均能保持麻醉狀態，具體臨床表現及死亡數見表1。

表1 9組呼吸機所致肺損傷家兔模型臨床表現及死亡率

2.2 血流動力學及呼吸力學參數 各組動物在通氣開始時，MAP 為(103．2±7．3)mmHg，HR 為(204．9 ±17．4)/min，Ppeak 為(12．3 ±1．1)cmH2O，Pplat為(8．6 ±1．2)cmH2O，氧合指數(PaO2/FiO2)為(465．5 ±24．2)mmHg。VT20、VT40 組內隨著通氣時間的延長，MAP及 HR呈不同程度下降，且VT40組較VT20組下降更明顯，甚至出現不同程度的缺氧、休克表現及死亡，見表2。

VT10組通氣過程中Ppeak相對穩定，VT20組和VT40組在通氣過程中Ppeak呈基本上升趨勢，VT40組升高最為顯著，與VT10組和VT20組同時間點比較差異均具有顯著性(P＜0.05)。見表2。

VT10組在各時間點PaO2/FiO2保持穩定，與0 h比較均無顯著差異(P＞0．05)。VT20和 VT40兩組PaO2/FiO2隨通氣時間延長有下降趨勢，其中VT20組的2 h后與0 h比較差異均有顯著性但PaO2/FiO2均 ＞300 mmHg，而4 h、6 h 點 PaO2/FiO2均＜300 mmHg，VT40組通氣中不同時間點與0 h比較都有明顯下降(P＜0．05)，其中 2、4、6 h的PaO2/FiO2值均 ＜300 mmHg，見表2。

2.3 肺組織病理改變 VT10組肺組織肉眼及光鏡下未見明顯的改變。VT20組隨著通氣時間延長，可見一定程度的肺損傷，至通氣6 h時，大體標本肉眼可見散在出血點，鏡下表現為肺間隔增寬，炎性細胞浸潤，肺泡腔少量滲出。而VT40組通氣2 h后肺組織就出現了顯著的損傷改變，大體標本可見點、片狀出血，鏡下見肺泡結構變形、間隔增寬及肺泡腔融匯，大量滲出，炎性細胞大量積聚，部分肺組織實變。肺病理改變隨通氣時間的延長而加劇。見圖1。

表2 9組呼吸機所致肺損傷家兔模型血流動力學及呼吸力學參數比較(±s)

表2 9組呼吸機所致肺損傷家兔模型血流動力學及呼吸力學參數比較(±s)

注:VT10-2、4、6:潮氣量為 10 ml/kg，通氣時間為 2、4、6 h;VT20-2、4、6:潮氣量為 20 ml/kg，通氣時間為 2、4、6 h;VT40-2、4、6:潮氣量為40 ml/kg，通氣時間為2、4、6 h;與VT10組相同通氣時間的亞組比較，a P＜0．05;與VT20組相同通氣時間的亞組比較，c P ＜0．05

組別 兔數 平均動脈壓(mmHg)心率(/min)氣道峰壓(cmH2 O)氣道平臺壓(cmH2 O)氧合指數(mmHg)VT10-2 6 105．4 ±6．9 202．9 ±15．8 12．4 ±1．3 9．5 ±1．1 459．3 ±25．8 VT10-4 6 100．2 ±8．8 200．2 ±16．4 13．3 ±1．2 9．6 ±1．2 425．1 ±33．2 VT10-6 6 95．4 ±9．1 194．5 ±18．2 14．6 ±1．1 11．3 ±1．5 418．6 ±26．6 VT20-2 6 100．4 ±6．5 193．4 ±16．8 20．1 ±1．8a 16．3 ±2．1a 339．7 ±28．8a VT20-4 6 96．1 ±8．3 190．2 ±17．1 22．3 ±2．2a 18．4 ±1．9a 295．2 ±23．4a VT20-6 5 91．4 ±7．1 174．5 ±18．3 27．6 ±2．5a 19．7 ±2．3a 228．2 ±22．7a VT40-2 5 97．5 ±6．6 188．2 ±17．3 29．1 ±2．8ac 18．2 ±2．0a 279．3 ±25．1ac VT40-4 4 85．2 ±7．1a 167．5 ±16．3a 32．4 ±2．6ac 22．6 ±2．6ac 220．1 ±24．2ac VT40-6 3 78．4 ±7．4ac 154．8 ±17．6a 39．5 ±3．2ac 26．7 ±3．9ac 188．7 ±20．5 ac

圖1 呼吸機所致肺損傷家兔模型肺組織大體及肺組織病理學觀察(HE×100)

2.4 肺濕干比、BALF蛋白含量、有核細胞總數及中性粒細胞計數 各組家兔的肺濕干比、BALF蛋白含量、有核細胞總數及中性粒細胞計數均隨通氣時間延長而升高，差異有統計學意義的組具體見表3。雖部分結果無統計學意義(P＞0.05)，但VT10-6、VT20-6、VT40-6亞組均顯著高于同組內2 h亞組(P＜0．05)，VT40-6亞組顯著高于 VT40-4亞組(P＜0．05)。VT40-4亞組BALF蛋白含量、有核細胞總數及中性粒細胞計數顯著高于VT10-4亞組及VT20-4亞組(P＜0．05)。隨潮氣量加大，部分相同通氣時間組間比較差異有統計學意義的組具體見表3。

表3 9組呼吸機所致肺損傷家兔模型檢測指標比較(±s)

表3 9組呼吸機所致肺損傷家兔模型檢測指標比較(±s)

組別 例數 肺濕干比值BALF蛋白含量(g/L)有核細胞總數(×109/L)中性粒細胞計數(×109/L)VT10-2 6 2．21±0．35 0．39±0．04 23．2±1．7 1．13±0．21 VT10-4 6 2．78±0．55 0．47±0．06a 25．2±2．2 1．44±0．19a VT10-6 6 3．77±0．75a 0．53±0．06a 27．2±2．7a 1．77±0．25a VT20-2 6 2．73±0．51 0．57±0．05c 34．6±3．7c 1．89±0．21c VT20-4 6 3．60±0．62ac 1．21±0．10ac 41．2±4．3ac 2．46±0．33ac VT20-6 5 4．00±0．67a 1．53±0．14ac 47．9±4．7ac 3．21±0．45ac VT40-2 5 3．54±0．76c 0．79±0．07ce 38．8±3．4ce 2．16±0．24ce VT40-4 4 4．32±0．78c 1．62±0．15ace 52．7±9．1ace 4．44±0．50ace VT40-6 3 4．94±0．78aceg 1．90±0．17aceg 61．2±9．6aceg 8．67±0．95 aceg

注:VT10-2、4、6:潮氣量為10 ml/kg，通氣時間為2、4、6 h;VT20-2、4、6:潮氣量為 20 ml/kg，通氣時間為 2、4、6 h;VT40-2、4、6:潮氣量為 40 ml/kg，通氣時間為 2、4、6 h;與同一潮氣量組內2 h比較，aP＜0．05;與 VT10組相同通氣時間比較，cP ＜0．05;與 VT20 組相同通氣時間比較，eP ＜0．05;與VT40-4組比較，gP ＜0．05

3 討論

在臨床上機械通氣是危重患者救治過程中不可缺少的呼吸支持技術，ALI/ARDS是呼吸機使用的主要適應證。然而，機械通氣如果使用不當也可誘發或加重肺損傷，即引發VILI，其發生率高達15%，甚至引發肺外多系統器官功能衰竭(MSOF)［2-3］。目前研究發現，過度通氣的機械牽張可導致肺組織生物傷，加重肺損傷。有學者證明，機械通氣相關性肺損傷是因高氣道壓和(或)高容量導致吸氣末肺組織過度擴張和因呼氣末肺容積過低使不張的終末小氣道和肺泡隨機械通氣周期性地開放和關閉所致的肺機械性損傷［4］。此外，在肺機械性損傷的基礎上肺內炎性細胞聚集和炎癥遞質釋放進一步促進了機械通氣相關性肺損傷的發生和發展［5］。因此，VILI表現形式多樣，不僅表現為肺泡外氣體，還包括肺泡上皮和血管內皮的廣泛性破壞、肺水腫和肺不張等彌漫性肺損傷，在臨床上VILI的防治已受到人們越來越多的關注。在臨床疾病的研究中，由于臨床病例資料(尤其是病理資料)收集存在一定的困難，故動物模型在研究ALI中發揮著不可替代的重要作用，但同時動物模型的復制也是ALI的研究的難點［6］。模型動物的可選擇種類相當廣泛，包括大鼠、小鼠、家兔、犬、豬、綿羊、山羊及靈長類動物等。家兔機體抵抗力較弱，性格溫順易操作，能夠滿足一定的采血量，且成本適中［7］。

目前認為大潮氣量合并無呼吸末正壓的通氣是復制VILI最簡單和有效的方法［8］，致傷性通氣造成肺損傷的嚴重程度取決于機械應力的強度和時間［8-10］。因此，本實驗選擇不同VT機械通氣(VT10 ml/kg、20 ml/kg、40 ml/kg)、分別予不同通氣時間(2 h、4 h、6 h)，以期尋找一最佳的建立家兔VILI模型的通氣條件。研究表明［11-12］，正常家兔以 45 cmH2O的吸氣峰壓分別通氣5、10、20 min，動物即可出現緊急致命的肺損傷。而相比之下，使用增加不大的VT通氣，造成的肺部損傷是隱匿而緩慢的，動物能存活數小時至數天。由此可見，選擇適度的致傷性通氣方式是建立VILI模型的關鍵，致傷因素既不能引起動物的急進性死亡，又要在實驗時間內足以造成典型的肺損傷。

本研究以肺組織病理學作為評價肺損傷程度的客觀指標，以PaO2/FiO2＜300 mmHg作為呼吸功能失代償判斷標準［13］，在實驗中由于吸入氧濃度保持不變，故動脈血PaO2的變化能間接反映肺功能的變化，結合其他相關肺損傷測定參數可綜合評價VILI模型建立的成功與否。目前認為ALI/ARDS及VILI等均是由于損傷肺泡毛細血管膜導致的病理生理改變。故評價肺損傷的指標集中于以上的機制及病理改變，包括肺水腫液的重量測量、肺順應性、影像學、組織學評價、肺泡及血管的滲透性改變及BALF中蛋白、促炎因子及炎癥因子等，這些指標均與肺損傷后病情的嚴重程度呈一定的正相關關系［14-16］。本實驗結果顯示:VT10組在各時間點PaO2/FiO2保持穩定，與0 h比較均無顯著差異。VT20和VT40組PaO2/FiO2隨通氣時間延長有下降趨勢，其中VT20組通氣4 h、6 h后PaO2/FiO2均＜300 mmHg，VT40 組通氣后2 h、4 h、6h 的 PaO2/FiO2值均＜300 mmHg。VT10組肺組織肉眼及光鏡下未見明顯的改變。VT20組隨著通氣時間延長，可見一定程度的肺損傷，至通氣6 h時，大體標本肉眼可見散在出血點，鏡下主要表現為肺間隔增寬，炎性細胞浸潤，肺泡腔少量滲出。而VT40組通氣2 h后肺組織就出現輕度損傷改變，通氣4 h損傷顯著，大體標本可見點、片狀出血，鏡下見肺泡結構變形、間隔增寬及肺泡腔融匯，大量滲出，炎性細胞大量積聚，部分肺組織實變。這兩項指標均充分說明在VT為20 ml/kg下通氣6 h及40 ml/kg下通氣4 h、6 h均可造模成功，相應的肺濕干比，BALF蛋白含量及BALF有核細胞總數和中性粒細胞計數這幾個指標結果均可驗證。

總之，綜合動物死亡率、造模成本、病理切片效果等考慮，應該認為以VT40 ml/kg通氣4 h為成功復制病變典型的呼吸機所致肺損傷家兔模型的最佳條件。

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