不同方法提取高致病性禽流感及新城疫病毒RNA效果的比較分析

吳蔚 詹文輝 李鶴 應清香 廖媛 王邦彥 福建省南平市動物疫病預防控制中心 353000

不同方法提取高致病性禽流感及新城疫病毒RNA效果的比較分析

吳蔚 詹文輝 李鶴 應清香 廖媛 王邦彥 福建省南平市動物疫病預防控制中心 353000

高致病性禽流感以及新城疫對禽養殖戶危害巨大，應用熒光RT-PCR方法對高致病性禽流感、新城疫病毒進行檢測在病原學檢測中占據優勢。而熒光RT-PCR檢測的核心是核酸物質的提取。本文將離心柱內硅基質膜提取法（柱膜法）與磁珠法作比較，探討更適合基層獸醫實驗室的核酸提取方式。

柱膜法 磁珠法 提取 比較

高致病性禽流感（以禽流感H5、H7為代表）及新城疫對禽養殖戶危害巨大，均屬于我國規定的一類動物疫病。RT-PCR方法結合熒光探針的擴增檢測技術[1]，通過熒光信號的變化檢測高致病性禽流感及新城疫病毒RNA，為我國目前較為準確的檢測手段。而提取高致病性禽流感及新城疫病毒RNA有多種方法[2]，離心柱內硅基質膜提取法（以下簡稱“柱膜法”）與磁珠法是各種方法中的佼佼者，本文將這兩種方法作比較，闡述如下。

1 材料與方法

1.1 樣本與試劑樣本分別為禽流感H5、H7及新城疫陽性、陰性對照品（深圳凱杰生物工程有限公司）。柱膜法采用凱杰生物的試劑盒，磁珠法采用天隆科技的試劑盒。

1.2 儀器微量可調節移液器、高速臺式冷凍離心機、核酸提取儀NP968型（西安天隆科技有限公司）、PCR熒光檢測儀（凱杰生物工程有限公司）。

1.3 方法

1）以禽流感H5為例：將禽流感H5陽性對照品、陰性對照品分為兩組，一組用柱膜法提取RNA，另一組用磁珠法提取RNA。柱膜法的提取過程為：化學裂解-過柱吸附-洗滌-洗脫，全程人工提取，在生物安全柜內操作。磁珠法的提取過程為：化學裂解-加磁珠吸附-洗滌-洗脫，由核酸提取儀半自動操作。樣本分別經過柱膜法和磁珠法處理后，提取的產物（洗脫產物）均加入擴增試劑（RT-PCR反應液、RT-PCR酶、Taq酶），分裝，放入PCR熒光檢測儀內設置好循環條件同時進行RT-PCR反應，反應完成后根據樣本Ct值的大小及擴增曲線的形成情況判定結果。

2）禽流感H7和新城疫的RNA提取過程同禽流感H5，檢測樣本換成禽流感H7及新城疫陽性、陰性對照品。

2 結果

高致病性禽流感、新城疫病毒熒光RT-PCR的結果分別見圖1-圖3。

2.1 兩種方法提取禽流感病毒H5的比較柱膜法提取的陽性對照品（1號線）的Ct值為17.43，磁珠法提取的陽性對照品（2號線）的Ct值為14.42，柱膜法和磁珠法分別提取的陰性對照品（3、4號線）的Ct值均為none。見圖1。

圖1 兩種方法提取禽流感H5病毒RNA效果的比較

2.2 兩種方法提取禽流感病毒H7的比較柱膜法提取的陽性對照品（1號線）的Ct值為18.75，磁珠法提取的陽性對照品（2號線）的Ct值為15.14，柱膜法和磁珠法分別提取的陰性對照品（3、4號線）的Ct值均為none。見圖2。

圖2 兩種方法提取禽流感H7病毒RNA效果的比較

2.3 兩種方法提取新城疫病毒的比較柱膜法提取的陽性對照品（1號線）的Ct值為14.00，磁珠法提取的陽性對照品（2號線）的Ct值為11.45，柱膜法和磁珠法分別提取的陰性對照品（3、4號線）的Ct值均為none。見圖3。

3 分析與討論

1）結果表明，無論是柱膜法還是磁珠法，均對高致病性禽流感及新城疫病毒RNA有較好的提取效果。因為圖1-圖3所示的陽性對照品的Ct值均小于30，而陰性對照品的Ct值均為none。

圖3 兩種方法提取新城疫病毒RNA效果的比較

2）由于是直接用陽性對照品和陰性對照品作為樣本來進行，基本排除了樣本因素[3]（如樣本溶血等）對本試驗的影響。因條件所限，沒有設立已知拷貝數的樣品進行絕對定量的分析[4-5]，故無法計算出使用這兩種方法提取的起始模板量，待將來作進一步研究討論。

3）從圖1-圖3可以看出，采用柱膜法提取的組分的Ct值均大于采用磁珠法提取的組分的Ct值，一般差2～3個循環。而Ct值越大則表明在PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環次數越大，這就意味著相對磁珠法來說，采用柱膜法提取的效果略差。

4）兩種方法雖然在試驗結果上略有差異，但并不影響基層獸醫實驗室對高致病性禽流感及新城疫病毒檢測定性的要求。柱膜法基本通過人工操作，對人員以及環境要求較高，且操作較為繁瑣，但費用較磁珠法少。磁珠法通過儀器的精密控制，減少了人工操作環節引起的差異和錯誤，通量較大，一次可以同時處理32個樣本（最多可處理96個樣本），但處理每個樣本的成本較高。因此，在基層獸醫實驗室的實際應用過程中，應當根據自身情況選擇合適的方法來進行高致病性禽流感及新城疫病毒RNA的提取。

[1]楊新,劉澤軍.實時熒光定量RT-PCR定量分析mRNA表達水平原理及應用[J].中國檢驗醫學與臨床,2003,4(2): 78-80.

[2]張麗,楊蓮茹,吳紹強.核酸提取方法的研究進展[J].中國動物檢疫,2011,28(12):75-78.

[3]高國生,姜俊,翁彭劍.不同標本因素對熒光定量PCR法測定HBV DNA結果的影響[J].現代實用醫學,2010,22(1): 37-38.

[4]盧體康,秦智鋒,陳兵,等.H7亞型禽流感病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].動物醫學進展,2012,33 (3):9-13.

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Comparison of different RNA isolation methods for Highly pathogenic avian influenza and Newcastle disease

Wu Wei Zhan Wenhui Li He Ying Qingxiang Liao Yuan Wang Bangyan
（Nanping Center for Animal Disease Control and Prevention,Fujian 353000）

Highly pathogenic avian influenza and Newcastle disease do the great harm to poultry farmers,FQ-PCR have an advantage in detecting method of etiology and Nucleic acid extraction is the key.This article compares Centrifugal column extraction with magnetic bead method in order to find a better way in Basic veterinary laboratory.

Centrifugal column extractionmagnetic bead methodExtractionComparison

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1003-4331（2014）06-0007-02