紫莖澤蘭多糖的免疫調節活性研究

萬春燕，周緒斌

(1.中國農業大學，北京 100093；2.新疆天康畜牧生物技術股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830032)

1 紫莖澤蘭多糖的提取

取100 g陰涼處干燥的紫莖澤蘭葉片，將葉片剪碎，輾成粉，40目過濾篩過濾。再將其溶于1 000 mL蒸餾水中，于超聲波提取裝置中提取40 min，收集上清液，沉淀物再懸浮于1000 mL蒸餾水，再次通過超聲處理提取30 min，將得到的上清液與前一次所得合并，最后在旋轉蒸發器中將水相蒸發至干，得到的殘留物溶解在蒸餾水中，并在4℃下冷凍保存。

2 紫莖澤蘭多糖的純化制備

將萃取液在3 000 g/min離心25 min，80 ℃下進行濃縮8 h，以制備多糖，將上清液用Sevag法脫蛋白。必要時可用紫外分光光度計測 250～280 nm沒有吸收峰方可確定除凈了蛋白。將上層清液用2 mol/L 氫氧化鈉調至pH=7，加熱回流用1%活性炭脫色。

取除雜蛋白后的溶液10 mL，裝入截留分子量為8 000～15 000的透析袋中透析脫鹽及小分子雜質，透析液離心（3 000 r/min，10 min），上清于80 ℃水浴濃縮至原體積的1/3。然后加入4倍體積95%乙醇（v/v）沉淀24 h后，離心（3 000 r/min，15min），沉淀用無水乙醇洗滌2次，乙醚洗滌1次，真空干燥得紫莖澤蘭多糖樣品。

以葡萄糖作標準曲線，用苯酚-濃硫酸分光光度法測醇沉淀物中的EAP糖含量。

3 紫莖澤蘭多糖對人源細胞和鼠源細胞的免疫調節作用

3.1 多糖的處理

1）將提取的紫莖澤蘭多糖溶于蒸餾水中，經0.45 μm和0.22μm的過濾器過濾，用細胞培養液稀釋；

2)將T25細胞培養瓶培養的人源（A549）細胞和鼠源（RAW264.7）細胞經胰酶消化后加入細胞培養液使其最終體積為20 mL，向6孔培養液中加入2 mL/孔，同時加入紫莖澤蘭多糖溶液200 μL/孔，使其最終濃度為50，100，200，400μg/mL，另外設脂多糖（LPS）組，每個梯度3個重復。空白對照加入200 μL相應的磷酸緩沖（PBS）液。

3)培養12 h，24 h，36 h每個濃度取3個樣品，提取細胞總RNA，采用熒光定量PCR方法檢測紫莖澤蘭多糖的免疫相關細胞因子IL-6，TNF-α，IFN-β，IFN-γ等。

3.2 采用Trizol法提取細胞總RNA，采用隨機引物合成cDNA

3.3 熒光定量PCR

用β-actin作為內參。獲得的實時定量PCR數據用2-ΔΔCT方法分析相關基因的表達。

3.4 數據分析

使用GraphPad Prism V5.01作圖并進行統計學分析。P＜0.05為差異顯著，在圖中用“*”表示。

4 結果

4.1 紫莖澤蘭多糖對人源細胞（A549）的免疫調節作用

4.1.1 不同濃度的EAP對A549細胞的影響

實驗選取的紫莖澤蘭多糖濃度分別為50μg/mL、100μg/mL、200 μg/mL和 400μg/mL， 分 別 作 用 于A549細胞，提取RNA，反轉錄為cDNA，用相對熒光定量PCR檢測細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ的mRNA表達情況。結果表明在200μg/mL時4種細胞因子的表達量都較高（P＜0.05）。

EAP終濃度分別為50 μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL，LPS對照的濃度為50 ng/mL，PBS組為陰性對照。從圖1中可以看出，IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ在EAP濃度為200 μg/mL時其mRNA的表達都顯著提高（P＜0.05）。EAP濃度200μg/mL與其他濃度相比提高效果最明顯。

4.1.2 不同時間點EAP對A549細胞的影響

圖1 采用相對熒光定量PCR方法測定不同濃度的EAP對A549細胞因子表達的影響

圖2 采用相對熒光定量PCR方法測定不同時間點EAP對A549細胞的影響

實驗選取了紫莖澤蘭多糖濃度為200 μg/mL，分別作用時間12 h、24 h和36 h于A549細胞，提取RNA，反轉錄為cDNA，用相對熒光定量PCR檢測細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ的mRNA表達情況。結果表明EAP濃度200 μg/mL作用36 h，IL-6、TNF-α和IFN-γ的表達量都較高（P＜0.05），IFN-β無統計學意義。

分別取EAP作用的3個時間點即12 h，24 h和36 h，測定不同時段細胞因子的表達情況，從實驗所得結果來看，36 h時EAP的作用相對較好，IL-6，TNF-α和IFN-γ都得到了上調表達（P＜0.05）。IFN-β在3個時間段的結果不顯著（圖2-2C）。

4.2 紫莖澤蘭多糖對鼠源細胞的免疫調節作用

4.2.1 不同濃度的EAP對RAW264.7細胞的影響

實驗選取了紫莖澤蘭多糖（EAP）濃度分別為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和 400μg/mL，分別作用于RAW264.7細胞，提取RNA，反轉錄為cDNA，用相對熒光定量PCR檢測細胞因子IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ的mRNA表達情況。結果表明在200μg/mL時4種細胞因子的表達量都較高（P＜0.05）。

實驗分別設定了紫莖澤蘭多糖的4個濃度梯度，50μg/mL、100μg/mL，200μg/mL和400μg/mL，另外設PBS空 白 對 照 組。IL-6、TNF-α、IFN-β 和IFN-γ 都 在EAP濃度為200μg/mL的時候表達量最高。200μg/mL的紫莖澤蘭多糖與PBS組相比差異顯著（P＜0.05）。

4.2.2 不同時間點EAP對RAW264.7細胞的影響

圖3 采用相對熒光定量PCR方法測定不同濃度的EAP對RAW264.7細胞的影響

圖4 采用相對熒光定量PCR方法測定不同時間點EAP對RAW264.7細胞的影響

圖5 測定不同濃度EAP對小鼠巨噬細胞RAW264.7的吞噬李氏桿菌的刺激作用

實驗選取的紫莖澤蘭多糖濃度為200μg/mL，分別作用時間12 h、24 h和36 h于A549細胞，提取RNA， 反轉錄為cDNA，用相對熒光定量PCR檢測細胞因子IL-6、T N F-α、I F N-β和I F N-γ的mRNA表達情況。結果表明EAP濃度200μg/mL作用36 h，IL-6、TNF-α和IFN-γ的表達量都較高（P＜0.05），IFN-β結果不顯著。

從這4個因子（IL-6、TNF-α、IFN-β和IFN-γ)的表達情況來看，36 h與12 h和24 h相比，更具有優勢，與對照組相比，差異顯著（P＜0.05）。

4.3 巨噬細胞的吞噬能力測定

實驗測定了EAP濃度分別為100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL時RAW264.7細胞對李氏桿菌的吞噬作用，用LPS作陽性對照，結果表明200μg/mL的EAP具有促進RAW264.7細胞吞噬細菌的作用。

分別選取了100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL的EAP濃 度 梯 度，Lipopolysaccharides(LPS)為 50 ng/mL。以LPS為陽性對照，PBS為陰性對照，EAP作用36 h后，200μg/mL濃度的紫莖澤蘭多糖與陰性對照組相比吞噬能力較好(P＜0.05)。

5 分析與討論

目前關于植物多糖的抗氧化能力和增強宿主免疫活性的作用方面的研究還較少。本試驗通過對體外人源細胞A549細胞和鼠源細胞RAW264.7的細胞因子的測定發現，在EAP濃度為200μg/mL，作用時間為36 h時表達水平較高。EAP對A549細胞和RAW264.7細胞的免疫調節活性與EAP的劑量成一定的依賴關系。EAP能顯著提高這2種不同來源細胞 IL-6，TNF-α，IFN-β，IFN-γ 的 mRNA的表達水平。IL-6主要由巨噬細胞、成纖維細胞、B細胞、T細胞等多種細胞產生的，IL-6可以調節細胞的生長與分化，具有調節免疫應答、急性期反應、造血功能等，并在機體的抗感染免疫中發揮重要作用。許多抗原或非抗原物質可誘導IL-6的產生，如植物多糖和細胞因子等，TNF-α和IL-6可以互相誘導產生，互相進行調控。IL-6可通過核轉錄因子（NF-κB）介導炎癥，NF-κB在激活上皮細胞、巨噬細胞和T細胞等細胞中的各種促炎癥因子起著重要作用。TNF-α是由活化的單核細胞、巨噬細胞、T細胞等產生的能使腫瘤壞死的因子，脂多糖（LPS）、病毒、真菌、免疫復合物和其他非抗原物質均具有刺激TNF-α產生的作用。TNF-α具有抗病毒、細菌、激活T細胞，促進IL-6的產生和分泌的作用，并誘導炎癥反應，促進主要組織相容性抗原Ⅱ類抗原(MHCⅡAg)的表達等，與宿主防御反應相關。TNF-α在濃度較低時，它主要作為內皮細胞和白細胞自分泌和旁分泌的調節物質，調節免疫反應，參與抗病毒、抗腫瘤作用等。干擾素（IFN）是動物機體細胞在誘導劑作用下產生的一組低分子量的具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節活性的糖蛋白。IFN-β具有免疫調節作用，它能促進大多數細胞MHCⅠ類抗原的表達，激活細胞毒性T淋巴細胞（CTL）和自然殺傷（NK）細胞，另外還具有一定的廣譜抗病毒作用。T細胞受到刺激后可產生IFN-γ，目前認為，巨噬細胞活化因子（MAF）的主要活性存在于IFN-γ中，IFN-γ能誘導MHCⅡ類抗原的表達，協同TNF促進細胞殺傷病原微生物。紫莖澤蘭多糖作為細胞體外刺激物，它能以一定的作用機制調節上皮細胞和巨噬細胞內IL-6、TNF-α、IFN-β、IFN-γ的表達，這對細胞的免疫反應具有一定的作用。

以往的研究表明巨噬細胞受到刺激后，能夠產生細胞因子如IL-6和TNF-α。T細胞分泌的IL-6能刺激巨噬細胞的免疫反應。巨噬細胞分泌的TNF-α已確定是重要的宿主調節分子，與腫瘤壞死相關。紫莖澤蘭多糖對RAW264.7細胞和A549細胞具有一定的免疫調節作用，這種結構的多糖可能與細胞表面受體有一定關聯，從而導致免疫反應的發生，但這還需要進一步的研究加以證明。巨噬細胞在抵御宿主感染和破壞外來病原體和腫瘤細胞中發揮了重要作用。在哺乳動物中，吞噬是一個重要的防御機制，它能夠使機體免受病原體的入侵，巨噬細胞、樹突狀細胞和粒細胞對凋亡細胞具有清除作用。巨噬細胞的非特異性防御功能可能是在吞噬過程中消除階段通過激活溶酶體磷酸酶而發揮的，由于吞噬細胞的監管和效應細胞在免疫系統的作用，通過增強巨噬細胞功能，將適用于微生物感染和癌癥的治療領域。

研究結果表明，EAP可以刺激A549細胞和RAW264.7細胞的免疫反應，可能是由于提取方法，單糖單位，結構特征和分子質量等的綜合作用。也可能是由于巨噬細胞膜上的受體（包括dectin-1，甘露糖受體，Toll樣受體等），這些受體識別多糖將產生細胞增殖，引起一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）的產生，細胞因子或者趨化因子的生產，增強吞噬作用。一旦免疫反應開始，巨噬細胞將使用NO、ROS或TNF-α攻擊外來病原體和誘導細胞凋亡，然后吞噬或傳遞給抗原呈遞細胞和自然殺傷細胞或細胞毒性T淋巴細胞來識別并消除它們。因此EAP被認為是新型植物多糖，可以用來激活免疫系統，迅速形成巨噬細胞作為主體的第1道防線。因此， EAP對于免疫佐劑的開發或免疫調節劑的研制作用甚大，有可能會成為一種廣譜的抗病毒藥物。

略