均勻設(shè)計優(yōu)化杏鮑菇酒發(fā)酵工藝

田廣文，王瑩，陳德育，*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程08級，陜西楊凌712100）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側(cè)耳，因其子實體具杏仁香味和菌肉肥厚似鮑魚而得名。據(jù)分析，杏鮑菇子實體含有18 種氨基酸，其中8 種是人體必需氨基酸，且都是L-型，易被人體吸收利用，同時含有豐富的粗蛋白質(zhì)和寡糖[1-6]，適用于保健食品開發(fā)。

當(dāng)前，楊凌區(qū)多家食用菌廠都存在著鮮杏鮑菇產(chǎn)出后剩余大量殘次菇及修整下腳菇（占產(chǎn)量10%～15%），一般做法是低價處理給農(nóng)戶或飼料廠，收益率較低。可見，開發(fā)利用這些菇的深加工對提高杏鮑菇產(chǎn)品的附加值，促進(jìn)當(dāng)?shù)匦吁U菇的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有十分重要的意義。

本實驗以殘次杏鮑菇及修整下腳菇為原料，探討了釀造杏鮑菇酒的生產(chǎn)工藝。在實驗中采用單因素實驗、正交試驗、均勻設(shè)計實驗等方法對杏鮑菇酒的生產(chǎn)工藝路線及條件進(jìn)行逐步優(yōu)化，得到可行的工藝方案，取得滿意效果，可為實際生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

殘次鮮杏鮑菇及修整下腳料菇：本地多家食用菌廠；白砂糖：市售優(yōu)級；啤酒酵母斜面：本學(xué)院微生物學(xué)教學(xué)實驗室保存；常規(guī)試劑：無水亞硫酸鈉、無水檸檬酸、抗壞血酸等均為分析純。

1.2 主要設(shè)備與儀器

OP-C180 歐派果菜榨汁攪拌機：廣州佛山市順德區(qū)金一百實業(yè)有限公司；AUY220 型電子天平：日本SHIMADZU；DH6000AB 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PHS－3C 精密pH 計：上海精密儀器儀表有限公司；WYT-4 型手持糖量計：泉州中友光學(xué)儀器有限公司；TDL-5-A 離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；真空抽濾機：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SW-CJ-2F 潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；耀華3×1 組酒精計：河北省冀州市耀華器械儀表廠。

1.3 杏鮑菇酒發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程[1，6]

1.4 試驗方法[6-10]

1.4.1 單因素和正交試驗

以感官評分為指標(biāo)，分別研究菇漿用量、發(fā)酵糖度、酵母接種量等3 因素對杏鮑菇酒品質(zhì)的影響。然后采用L4（23）正交設(shè)計試驗以找出3 因素的最佳水平組合及影響次序。

1.4.2 均勻試驗設(shè)計優(yōu)化杏鮑菇酒發(fā)酵工藝

均勻設(shè)計法是在正交設(shè)計的基礎(chǔ)上創(chuàng)造出新的適用于多因素、多水平試驗的設(shè)計方法。它在尋找最佳實驗條件、最佳配比等方面是選擇優(yōu)化條件的有力工具，其長處在于在盡可能少的實驗次數(shù)中分析出因素與指標(biāo)間的規(guī)律[11]。因此，在正交試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)方開泰均勻設(shè)計表U10*（108）及其使用表[12]，對菇漿用量、發(fā)酵糖度、發(fā)酵液酸度、酵母接種量和主發(fā)酵時間等5 因素進(jìn)行均勻設(shè)計發(fā)酵試驗，確定的試驗設(shè)計水平見表1。

表1 均勻發(fā)酵試驗設(shè)計水平表Table 1 Level table of uniform fermentation experimental design

1.4.3 發(fā)酵過程中相關(guān)分析方法與參數(shù)的測定[1][6-10][13]

酒精度測定：按GB/T 15038—2006（葡萄酒、果酒通用分析方法）中酒精計法；總酸（檸檬酸計）：按GB/T 15038—2006（葡萄酒、果酒通用分析方法）中指示劑法；總糖、還原糖測定：按GB/T 15038—2006（葡萄酒、果酒通用分析方法）中直接滴定法；糖度：手持糖度儀；細(xì)菌總數(shù)按GB4789.2-2010（食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定） 規(guī)定方法檢測；大腸桿菌按GB4789.3-2010（食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)）規(guī)定方法檢測；總SO2、游離SO2按GB/T15038—2006（葡萄酒、果酒通用分析方法）測定；原酒風(fēng)味：感官鑒定法（以表2 為標(biāo)準(zhǔn)）。酒透明度的測定：采用721分光光度法，在720 nm 下測定酒的透光率[15]。

表2 感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard

1.4.4 回歸分析評價系統(tǒng)[3，14]

將酒度Y1與感官評分Y2的結(jié)果，用模糊數(shù)學(xué)進(jìn)行數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化處理后得Y1*、Y2*，再以權(quán)重向量bn作為目標(biāo)因變量用SPSS 10.1 軟件對其進(jìn)行數(shù)值模擬回歸分析。

權(quán)重向量bn的確定：在多目標(biāo)方案的決策中，需要根據(jù)各目標(biāo)的數(shù)值分布特點和重要性程度確定指標(biāo)的權(quán)重。通常確定權(quán)重的方法有專家賦權(quán)法和客觀定權(quán)法[14]。依據(jù)果酒品質(zhì)評定慣例及經(jīng)驗，在酒度符合要求的基礎(chǔ)上，要體現(xiàn)酒的特色，感官評分應(yīng)較酒度更重要，所以本實驗確定杏鮑菇酒的權(quán)重向量bn=0.40Y1*+0.60Y2*。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對杏鮑菇酒發(fā)酵的影響

菇漿用量要適當(dāng)，過少則產(chǎn)品風(fēng)味平淡無特色風(fēng)格；過多則使產(chǎn)品風(fēng)味太濃重，失去清新爽口感。在糖度為20%、酸度0.4%、接種量5%、溫度為26 ℃、發(fā)酵時間為15 d 的條件下，設(shè)置不同的菇漿量進(jìn)行單因素試驗，結(jié)果見圖1。

圖1 菇漿量對杏鮑菇發(fā)酵酒的影響Fig.1 Effect of eryngii amount on Pleurotus Eryngii Wine

圖1 表明，菇漿量在9%～11%時發(fā)酵較好，感官評分較高。

糖是酵母生長繁殖必需的碳源，也是發(fā)酵生成酒精的物質(zhì)來源。隨著糖含量增加，酵母的生長繁殖能力增強，發(fā)酵產(chǎn)物增多，產(chǎn)品品質(zhì)得以改善。在菇漿量10 %、酸度0.4 %、接種量5 %、溫度26 ℃、發(fā)酵時間15 d 的條件下，設(shè)置不同的糖度進(jìn)行單因素試驗，結(jié)果見圖2。

圖2 糖度對杏鮑菇發(fā)酵酒的影響Fig.2 Effect of Brix on Pleurotus Eryngii Wine

從圖2 得知，當(dāng)發(fā)酵液的糖度達(dá)到22%時，酵母發(fā)酵原酒的感官評分最高。因此，22%為最適糖度。

適當(dāng)?shù)膒H 是酵母酶系統(tǒng)正常發(fā)揮作用的必要條件。因為適當(dāng)?shù)某跏妓岫瓤梢砸种飘a(chǎn)酸菌的侵襲，純化和強壯酵母，使整個發(fā)酵過程處于穩(wěn)定狀態(tài)[8]；酸也使酒顏色鮮明，酒味清爽，并具有柔軟感；酸與醇生成酯，增加酒的芳香；酸還能增加酒的貯藏性和穩(wěn)定性。如圖3 實驗發(fā)酵醪液初始一定要補加檸檬酸調(diào)酸度為0.4%～0.6%。

圖3 酸度對杏鮑菇發(fā)酵酒的影響Fig.3 Effect of acidity on Pleurotus Eryngii Wine

在主發(fā)酵過程中酵母生命活動旺盛產(chǎn)生大量熱量，使品溫升高，生成乙醇、二氧化碳和水。大量的二氧化碳、酒精等代謝產(chǎn)物會對酵母的糖代謝起反饋抑制作用[8]，使發(fā)酵作用過早停止，因此，酵母用量應(yīng)控制適宜，過少則發(fā)酵緩慢，有效物質(zhì)生成量較少，生產(chǎn)效率低且易受雜菌污染；過多則發(fā)酵劇烈，大量的二氧化碳與熱量使酵母活力迅速衰退，發(fā)酵后勁不足，發(fā)酵不充分且發(fā)酵產(chǎn)物少，產(chǎn)品風(fēng)味不理想。圖4 顯示酵母菌接種量在4%～5%較好。

圖4 接種量對杏鮑菇發(fā)酵酒的影響Fig.4 Effect of inoculum size on Pleurotus Eryngii Wine

2.2 杏鮑菇酒正交發(fā)酵試驗結(jié)果

由表3 的R 值可以看出B＞A＞C，即菇漿的糖度對發(fā)酵的影響最大，其次是菇漿量，接種量影響最小。最佳工藝配比是A1B2C2，即菇漿量在8%、糖量22%，接種量6%。

2.3 最佳發(fā)酵條件的確定

均勻設(shè)計試驗的結(jié)果見表4。

將表4 所得結(jié)果Y1、Y2用模糊數(shù)學(xué)進(jìn)行數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化[14]處理后得Y1*、Y2*，再以bn=0.40Y1*+0.60Y2*為目標(biāo)因變量用SPSS 10.1 軟件對其進(jìn)行數(shù)值模擬，發(fā)現(xiàn)X3、X4無顯著性意義，故將X3、X4除去并進(jìn)行了逐步回歸分析，得到回歸方程：Y*=－0.381 1+0.041 9X1+0.060 5X2+0.063 3X5，式中Y*為綜合評判值bn，X1為菇漿量，X2為糖度，X5為主發(fā)酵時間。對回歸方程進(jìn)行檢驗得出相關(guān)系數(shù)R2=0.933 0，F(xiàn) 值=35.778 6，顯著水平p=0.000 3，剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=0.099 6。

表4 均勻設(shè)計發(fā)酵試驗結(jié)果Table 4 Fermentation results of uniform experiment

表5 方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

回歸系數(shù)t 檢驗的結(jié)果見表6 被引入的有3 個回歸項，即X1、X2、X5項，各對杏鮑菇酒發(fā)酵影響的強弱次序為主發(fā)酵時間X5＞糖度X2＞菇漿量X1。

表6 參數(shù)估計Table 6 Parameter estimation

從回歸方程知菇漿量X1、糖度X2和主發(fā)酵時間X5與綜合評判Y*呈正相關(guān)，說明在合適的酸度、接種量和發(fā)酵溫度情況下盡可能延長主發(fā)酵時間以使醪液中的糖分得以充分發(fā)酵。考慮到實際成本、酵母生長發(fā)酵最適糖度（不得大于25%）和適宜酸度，以及正交試驗結(jié)果，得出最優(yōu)組合應(yīng)為：X1取水平6（即菇漿量8%），X2取水平7（即糖度22%），X3取水平2（即酸度0.4%），X4取水平8（即接種量6%），X5取水平10（即17 d），代入回歸方程求出最優(yōu)解：Y*=0.927 3（酒精度預(yù)測為11.8，感官評分預(yù)測為92），與均勻試驗6 結(jié)果很接近，證明回歸方程預(yù)測可靠。

2.4 杏鮑菇酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1，6-10]

2.4.1 感官指標(biāo)

外觀：亮麗的淺琥珀色、澄清透明、有光澤，無明顯懸浮物及沉淀；香氣：具有典型濃郁的杏鮑菇香氣和純正的酒香；口感：醇和、爽口、柔和、純正利口；滋味：菇鮮味明顯、適口，酒體回味愉快、綿長，無其他異味。常溫下貯存12 個月后有微量沉淀，但不失光澤。

2.4.2 理化指標(biāo)

酒精度10%～12%（20 ℃，體積分?jǐn)?shù)），總酸（以檸檬酸計）4 g/L～6 g/L，總糖（以葡萄糖計）≤8 g/L，游離SO2≤50 mg/L。

2.4.3 衛(wèi)生指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)≤50 cfu/mL；大腸菌群≤3 MPN/100 mL；致病菌（系指腸道致病菌）：不得檢出。

其它指標(biāo)符合GB2758—2012《發(fā)酵酒及其配制酒》衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論與討論

1）菌種選定：酒質(zhì)量的優(yōu)劣，很大程度上取決于菌種的發(fā)酵性能。酒精發(fā)酵是杏鮑菇酒釀造的最主要反應(yīng)，在酒精發(fā)酵過程中，酵母菌將糖轉(zhuǎn)化為酒精，同時還形成許多副產(chǎn)物（揮發(fā)酸、高級醇、脂肪酸、酯類等）。副產(chǎn)物是酒二類香氣的主要構(gòu)成物質(zhì)，二類香氣的優(yōu)雅度及其構(gòu)成是影響杏鮑菇酒質(zhì)量的主要原因之一，而這些副產(chǎn)物在酒中的含量主要取決于酒精發(fā)酵的條件，只有酒精發(fā)酵純正，發(fā)酵速度平穩(wěn)，才能保證各種副產(chǎn)物在果酒中處于相對平衡協(xié)調(diào)狀態(tài)[15]。本實驗選用經(jīng)活化和馴化處理的高活性啤酒酵母對杏鮑菇漿液進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)效率高，產(chǎn)品風(fēng)味純正。但發(fā)酵后殘?zhí)禽^高，因此杏鮑菇適合發(fā)酵半干型酒。

2）在杏鮑菇發(fā)酵釀酒的初期，加入檸檬酸調(diào)整酸度在4 g/L～6 g/L 既可有利于酵母菌的生長，又對發(fā)酵后酒的風(fēng)味起到良好的作用（如不調(diào)酸發(fā)酵后酒的口味很不協(xié)調(diào)）。

3）菇漿的用量對成品酒的質(zhì)量有直接影響。菇漿量過多，會使產(chǎn)品的風(fēng)味太濃，失去應(yīng)有清新爽口感；菇漿量過少，產(chǎn)品的風(fēng)味又不具特色風(fēng)格，因此菇漿量必須適當(dāng)。

4）杏鮑菇含豐富的粗蛋白，多數(shù)經(jīng)發(fā)酵分解生成氨基酸，提高了產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和風(fēng)味；有的蛋白質(zhì)還可以和發(fā)酵醪液中的酸類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生聚沉物，使酒品澄清透明，富有光澤。另外，杏鮑菇中含有豐富的纖維素（具有巨大的表面積）可以吸附醪液中的懸浮物并聚沉，也起到一定的澄清作用，因此本次試驗僅采用瓊脂（濃度0.5 g/L）澄清，就保證了原酒達(dá)到澄清透明。

5）本杏鮑菇酒正交實驗結(jié)果表明，在發(fā)酵溫度26 ℃條件下，發(fā)酵液糖度對發(fā)酵影響最大，其次是菇漿量，酵母菌接種量影響最小。得出的發(fā)酵條件為菇漿量8%，糖度22%，接種量6%。

6）通過均勻設(shè)計建立了杏鮑菇酒發(fā)酵的5 因素（菇漿量、發(fā)酵液糖度、發(fā)酵液酸度、酵母菌接種量、主發(fā)酵時間）回歸方程。回歸分析說明，發(fā)酵液酸度和酵母菌接種量對酒的品質(zhì)影響不顯著（P 值均大于0.05），而菇漿量、糖度、主發(fā)酵時間對酒品質(zhì)影響極其顯著（P 值小于0.01），影響的強弱次序為主發(fā)酵時間＞糖度＞菇漿量。最優(yōu)發(fā)酵條件是菇漿量8%，糖度22%，酸度0.4%，接種量6%，主發(fā)酵時間17 d。由此釀制的杏鮑菇酒具有獨特典型的杏鮑菇香氣和純正的酒香風(fēng)味。

7）成熟處理是提高酒品質(zhì)必要的過程，試驗得出杏鮑菇酒理想的成熟條件為16 ℃～18 ℃、30 d。

8）采用發(fā)酵法生產(chǎn)的杏鮑菇酒，是杏鮑菇多糖、糖肽等功能因子的良好載體，風(fēng)味純正，酒體豐滿，清澈明亮，同時富含氨基酸、維生素等營養(yǎng)成分。在發(fā)酵釀酒的過程中，酵母菌可將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醇類物質(zhì)，且能合成B 族維生素，部分蛋白質(zhì)被分解為氨基酸，所以杏鮑菇酒含有豐富的游離氨基酸、維生素B，具有較高的營養(yǎng)價值。杏鮑菇酒香氣濃郁，有獨特的杏仁香味，且入口柔滑，酒度小于12%，很適合于中青年人群飲用，可預(yù)防一些身心的疾病。

9）積極開展食用菌釀酒研發(fā)，大力推廣宣傳飲用菇類酒的益處，既能提高人們的品酒意識，又可及時補充人體需要的多種活性物質(zhì)，從而達(dá)到良好的食療保健效果。

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