片仔癀調控ABCC1抑制大腸癌HCT-8／5-FU細胞藥物外排功能的作用機制研究

黃進明，沈阿靈，李瓊瑜，齊 飛，洪 緋，陳宏偉，褚劍鋒，林久茂，洪振豐，彭 軍

（1.漳州片仔癀藥業股份有限公司，福建漳州363000；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122）

片仔癀調控ABCC1抑制大腸癌HCT-8／5-FU細胞藥物外排功能的作用機制研究

黃進明1，沈阿靈2，李瓊瑜2，齊 飛2，洪 緋1，陳宏偉2，褚劍鋒2，林久茂2，洪振豐2，彭 軍2

（1.漳州片仔癀藥業股份有限公司，福建漳州363000；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122）

目的 探討片仔癀對大腸癌HCT-8／5-FU細胞對藥物外排功能的影響，并探討其機制。 方法MTT法檢測5-FU對HCT-8／5-FU細胞和HCT-8細胞活力的影響和片仔癀對HCT-8／5-FU細胞活力的影響；倒置顯微鏡觀察片仔癀對HCT-8／5-FU細胞形態的影響；采用羅丹明染色通過流式細胞儀檢測片仔癀對其在耐藥細胞內蓄積的影響；RT-PCR檢測ABC轉運蛋白家族重要成員ABCC1的表達。 結果 MTT檢測結果顯示不同濃度的5-FU干預可顯著降低HCT-8細胞活力，呈現一定的劑量依賴和時間依賴，而對HCT-8／5-FU細胞活力未見影響。經片仔癀干預后，HCT-8／5－FU細胞活力也受到顯著的抑制；形態學觀察表明：隨著藥物濃度的升高，細胞數目逐漸減少，體積縮小，出現懸浮、脫落而死亡；羅丹明蓄積實驗顯示：片仔癀干預可顯著增加其在細胞內的蓄積；RT-PCR實驗表明：經片仔癀干預可顯著下調HCT-8／5-FU細胞ABCC1在mRNA水平的表達。 結論 片仔癀可抑制HCT-8／5-FU細胞生長和藥物外排功能，通過下調轉運蛋白ABCC1的表達是其重要機制之一。

片仔癀；大腸癌；逆轉耐藥；5-FU

大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其死亡率已位于惡性腫瘤第二位，嚴重危害人類健康［1］。大腸癌的治療過程中所產生的多藥耐藥的現象是造成當前化療失敗的最常見、最難解決的問題。多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是指在腫瘤細胞對一種化療藥物產生耐藥的同時，對其他結構、作用機制不同的藥物也產生耐藥現象［2］。腫瘤產生MDR的機制極其復雜，其中腫瘤細胞膜上的ATP結合盒式跨膜（ABC）轉運蛋白介導的藥物外排是MDR產生的主要機制［4］。ABCC1基因編碼的多藥耐藥性相關蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）是ABC（ATP binding cassette）轉運蛋白家族的重要成員之一［5］，是目前研究的熱點。

我國傳統中藥具有療效高、靶點多、不良反應少等特點，在逆轉耐藥的同時有殺傷腫瘤細胞、調節和提高機體免疫功能的多重功效［6-7］。片仔癀（PZH）是傳統名貴中成藥，由三七、麝香、牛黃、蛇膽等組成，已有研究［8-9］證實：片仔癀對許多晚期癌癥患者能明顯改善疼痛，縮小瘤體，延長生命，提高生活質量。本課題組前期研究發現片仔癀對大腸癌細胞有明顯抑制作用，具有多靶點抗腫瘤活性，既可以直接殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞生長或轉移，誘導細胞凋亡分化，抑制腫瘤干細胞的生長［10-16］，還可逆轉大腸癌耐藥［17］，但其逆轉耐藥的機制尚不明晰。故本文旨在探討片仔癀逆轉大腸癌5-FU耐藥的可能機制，進一步闡明片仔癀抗大腸癌的分子機制。

1 實驗材料

1.1 藥物和細胞株 人結直腸癌細胞株HCT-8／5-FU和HCT-8細胞購于南京凱基生物科技發展有限公司；片仔癀片劑（漳州片仔癀藥業股份有限公司，生產批號：0908035）；5氟尿嘧啶（5-FU，美國sigma公司）

1.2 試劑 RPMI-1640培養基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、瓊脂糖、羅丹明（美國Life technology公司）；Trizol試劑盒、RT試劑盒、PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；Goldview核酸染料（北京賽百盛基因技術有限公司）；無水乙醇、氯仿（分析醇，上海化學試劑采購供應站）；磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Hyclone公司）。

1.3 儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；ELX 800酶標儀（美國BioTek公司）；二氧化碳培養箱（德國Heraeus公司）；IX70熒光倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；9600型PCR儀（美國PE公司）；Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統、APC 300型電泳儀、水平式電泳槽（美國Bio-Rad公司）；5417R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；低速普通離心機（上海安亭科學儀器廠）；微調加樣器（德國Eppendorf公司）。

2 實驗方法

2.1 藥物的配制 PZH溶液：配制前將片仔癀用研磨棒研成粉末，用PBS配制成20 mg／mL的溶液，超聲溶解，高壓滅菌后-20℃貯存備用。5-FU溶液的配制：稱取適量5-FU粉末，溶解于DMSO配制成濃度為含1 M的5-FU溶液，超聲30 mim，分裝于-20℃貯存備用。使用前置室內恢復室溫，用培養基配制成含5-FU培養液。

2.2 細胞培養 采用單層貼壁細胞培養法培養，細胞用含10%FBS的RPMI-1640培養液（含100 U／mL青霉素、100 μg／mL鏈霉素），置于37℃含5%CO2和飽和濕度的培養箱中培養。加入0.8 mL 0.25%胰蛋白酶消化，后加入2.4 mL的新鮮培養基終止消化后，1 000 rpm／min離心5 min，棄上清收集沉淀細胞，用完全培養液重懸制成新細胞懸液后傳代或接種。HCT-8／5-FU和HCT-8細胞分別用含或不含5-FU（15 μg／mL）培養液中培養，實驗前或接板前改用不含5-FU的培養基培養。

2.3 MTT法檢測細胞活力 取對數生長期細胞，調整細胞終濃度為0.8×105／mL接種于96孔板中，每孔100 μL。分別加入終濃度為25～800 μM的5-FU或0.25～0.75 mg／mL的片仔癀干預。以不加藥細胞作為對照組，細胞經藥物干預一定時間后，每孔加入0.5 mg／mL的MTT溶液100 μL，37℃培養箱中孵育4 h后，棄去各孔中的MTT液體，加入DMSO各100 μL／孔，振蕩混勻，于全自動酶標儀570 nm測定各組吸光度值（即A值），并按下列公式計算細胞活力［8］：

細胞活力／%＝（實驗組A值／對照組A值）× 100%。

2.4 細胞形態觀察 HCT-8／5-FU細胞經不同濃度片仔癀（0 mg／mL，0.25 mg／mL，0.5 mg／mL，0.75 mg／mL）干預24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化并拍照（400×）。

2.5 羅丹明染色觀察細胞表面轉運蛋白外排功能取對數生長期的HCT-8／5-FU細胞，以2×105個／孔接種于六孔板，37℃培養24 h后，分別加入不同濃度的片仔癀干預，用胰酶消化成細胞懸液，離心收集細胞，調整細胞密度至1×106／mL重懸于培養基中，10 mM羅丹明染液染色，37℃，5%CO2細胞培養箱孵育10 min。用PBS清洗細胞2次，重懸細胞于PBS中，用流式細胞儀（激發波長488 nm）檢測熒光強度，判斷其在細胞內的蓄集。

2.6 RT-PCR檢測ABCC1的mRNA表達水平 取對數生長期的HCT-8／5-FU細胞，以2×105個／mL接種于六孔板，37℃培養24 h后，分別加入不同濃度的片仔癀干預24 h，用PBS洗清洗后每孔加入1 mL Trizol，按說明書進行RNA的抽提。采用逆轉錄（RT）試劑盒進行逆轉錄反應。RNA逆轉錄成cDNA后，在體外進行PCR的擴增反應。反應體系包括：cDNA1 μL上游引物，1 μL，1 μL下游引物，7 μL水及2×PCR Master Mix 10 μL，共20 μL。反應條件為：95℃預變性4 min，95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸45 s，持續35個循環，最后72℃延伸10 min，保存于4℃。ABCC1的引物序列為F：GTCGGGGCAT ATTCCTGGC；R：CTGAAGACTGAACTCCCTTCCT。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析后，置于凝膠成像系統進行分析，以GAPDH為內參基因。

2.7 統計學處理 實驗數據用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結 果

3.1 MTT實驗結果 MTT檢測細胞活力結果如圖1所示，經不同濃度的5-FU干預48 h后，HCT-8細胞活力顯著降低，而HCT-8／5-FU細胞活力下降不明顯，二者比較具有顯著性差異（P＜0.05），可見HCT-8／5-FU細胞具有一定的耐藥性。如圖2所示，與對照組比較，經不同濃度片仔癀（0 mg／mL、0.25 mg／mL、0.5 mg／mL、0.75 mg／mL）干預后，細胞活力顯著下降，具有顯著性差異（P＜0.05），并呈一定的劑量依賴。

圖1 不同濃度5-FU干預HCT-8／5-FU和HCT-8的細胞活力影響

圖2 不同濃度片仔癀干預對HCT-8／5-FU細胞活力影響

3.2 不同濃度片仔癀對HCT-8／5-FU細胞形態的影響 以不同濃度片仔癀干預24 h后，在倒置顯微鏡觀察細胞的形態變化，結果如圖3所示。對照組細胞均勻，核仁清楚，貼壁生長，片仔癀干預后，隨著藥物濃度的升高，細胞數目逐漸減少，體積縮小，甚至出現懸浮、脫落而死亡。

3.3 羅丹明染色檢測片仔癀對細胞藥物外排泵功能的影響 羅丹明染色檢測結果如圖4所示。經不同濃度的片仔癀干預后HCT-8／5-FU細胞中羅丹明熒光波峰右移，提示細胞內熒光明顯增強，證實PZH可增加HCT-8／5-FU細胞中羅丹明的蓄積。3.4 片仔癀對ABCC1在mRNA水平表達的影響RT-PCR檢測結果如圖5所示，以不同濃度PZH干預24 h后，與對照組比較，片仔癀能顯著下調ABCC1的mRNA水平的表達，提示通過下調ABCC1的表達可能是片仔癀抑制細胞外排功能的機制之一。

圖3 不同濃度片仔癀干預HCT-8／5-FU細胞的形態圖

圖4 不同濃度片仔癀對HCT-8／5-FU細胞內羅丹明蓄積的流式圖

圖5 不同濃度片仔癀干預后ABCC1的電泳圖

4 討 論

細胞表面存在具有能量依賴性“藥泵”功能的跨膜糖蛋白，能將細胞內帶陽性電荷的親脂類化療藥物逆濃度泵至細胞外，使細胞內化療藥物達不到有效作用濃度而產生耐藥性。耐藥基因高表達導致細胞對化療藥物的外排增加是導致多藥耐藥產生的最重要機制之一。目前進入臨床應用研究的西藥逆轉劑仍因作用機制單一、選擇性差、毒副作用明顯等原因使得其臨床應用受到了較大的限制，這也使得具有多成分、多靶點、多途徑治療作用的中藥備受關注。臨床和基礎研究均證實片仔癀可通過調控多條信號轉到通路及其下游靶基因表達誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖、抑制腫瘤血管新生、干細胞生長和逆轉耐藥的作用［14-21］。本文通過檢測片仔癀對細胞外排功能和轉運蛋白家族重要成員ABCC1的表達水平探討了片仔癀逆轉大腸癌的可能機制。MTT檢測結果表明：與其親本細胞相比，HCT-8／5-FU對5-FU具有一定的耐藥性，而不同濃度片仔癀作用下，細胞活力受到明顯抑制，并呈一定的劑量依賴。顯微鏡觀察進一步證實了片仔癀對HCT-8／5-FU細胞生長的抑制作用。羅丹明染色實驗證實了片仔癀干預可顯著增加羅丹明在HCT-8／5-FU細胞內的蓄集，降低細胞外排功能。RT-PCR檢測結果顯示：片仔癀干預可顯著下調ABC轉運蛋白ABCC1在mRNA水平的表達，該結果提示：通過抑制下調ABCC1的表達降低細胞外排功能可能是片仔癀逆轉大腸癌多藥耐藥的機制之一。

［1］ JEMAL A，BRAY F，CENTER M M，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［3］ BAGULEY B C.Multiple drug resistance mechanisms in cancer［J］. Mol Biotechnol，2010，46（3）：308-316.

［4］ 孫文霞，黃才國．腫瘤多藥耐藥：機制及逆轉劑［J］．生命的化學，2012，32（5）：395-399．

［5］ 李雅婷，竇駿．ABCC1介導多藥耐藥機制及其逆轉的研究進展［J］．醫學研究生學報，2007，20（4）：430-433．

［6］ 李景旺．中醫藥逆轉腫瘤多藥耐藥性的研究進展［J］．河北中醫，2007，29（6）：557-560．

［7］ 李志詢，劉宗榮，周銀桃，等．耐藥直腸癌細胞的耐藥機制及中藥逆轉耐藥機制的研究［J］．中國當代醫藥，2009，16（21）：7-9．

［8］ 顧兆雄．片仔癀治療晚期大腸癌25例療效觀察［J］．中成藥，1993，15（10）：23．

［9］ 劉叢盛．片仔癀臨床應用綜述［J］．北京中醫，2001，20（5）：63-64．

［10］SHEN A L，HONG F，LIU L Y et al.Pien Tze Huang inhibits the proliferation of human colon carcinoma cells via arresting G1／S cells cycle progression［J］.Oncology Letters，2012，4（4）：767-770.

［11］SHEN A L，CHEN Y Q，HONG F，et al.Pien Tze Huang suppresses IL-6-inducible STAT3 activation in human colon carcinoma cells through Induction of SOCS3［J］.Oncology Reports，2012，28（6）：2125-2130.

［12］SHEN A L，HONG F，LIU L Y，et al.Effects of Pien Tze Huang on angiogenesis in vivo and in vitro［J］.Chinese Journal of Integrative Medicine，2012，18（6）：431-436.

［13］ZHUANG Q C，HONG F，SHEN A L，et al.Pien Tze Huang inhibits tumor cell proliferation and promotes apoptosis via suppressing the STAT3 pathway in colorectal cancer mouse［J］.International Journal of Oncology，2012，40（5）：1569-1574.

［14］SHEN A L，LIN J M，CHEN Y Q，et al.Pien Tze Huang inhibits tumor angiogenesis in a mouse model of colorectal cancer via suppression of multiple cellular pathways［J］.Oncology Reports，2013，30（6）：1701-1706.

［15］WEI L H，CHEN P Y，CHEN Y Q，et al.Pien Tze Huang suppresses the stem-like side population in colorectal cancer cells［J］. Molecular Medicine Reports，2014，9（1）：261-266.

［16］魏麗慧，林久茂，彭軍，等．片仔癀對人結腸癌細胞株干細胞的影響［J］．福建中醫藥，2012，43（1）：45-47．

［17］蔡巧燕，沈阿靈，林久茂，等．片仔癀逆轉人結腸癌HCT-8／5-Fu耐藥性的實驗研究［J］．福建中醫藥，2013，44（1）：58-60．

R285.5

：A

：1000-338X（2014）06-0051-03

2014-9-20

國家自然科學基金（81373819）；中國博士后科學基金（2012M511437，2013T60636）

黃進明（1966—），男，主要從事中藥的研發工作。

彭軍（1969—），男，教授，博士生導師。

E-mail：pjunlab@hotmail.com