血必凈對膿毒癥大鼠腸道炎癥因子表達的影響

楊 玭 黃中偉 劉 春

1 江蘇省南通市急救中心 226001； 2 江蘇省南通大學附屬醫院急診科； 3 江蘇省南通大學實驗動物中心

嚴重膿毒癥是指膿毒癥伴低血壓或低灌注和至少一種器官功能障礙［1］。膿毒癥的本質是炎癥介質的失控釋放和炎癥反應紊亂［2］。腸道是人體內最大的“內毒素庫”和“貯菌所”，機體發生膿毒癥時，為保護心、腦等重要器官，全身血液被重新分配，胃腸血流減少，引起腸黏膜缺血，腸道屏障功能受損［3］，腸腔內毒素和細菌向腸道外移位可引發腸道局部或全身性不可控制的炎癥反應，可以認為胃腸道是SIRS的觸發器或始動器，是膿毒癥的“中心器官”。在炎癥因子復雜的連鎖反應中TNF－α和PAF可能起著重要作用。TNF－α是炎癥反應過程中出現最早的炎性介質，PAF是迄今發現的最強的血小板聚集誘導劑，通過和細胞膜表面的Pafr結合發揮生物學作用，本實驗通過構建膿毒癥動物模型，誘導TNF－α、PAF、Pafr表達變化，應用血必凈干預治療，分析膿毒癥腸道炎癥因子表達規律并探討血必凈對膿毒癥大鼠腸道保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與分組 健康雄性SD大鼠72只，體重（250±20）g（南通大學實驗動物中心提供），隨機分成3組，即對照組、模型組、治療組，各組又按術后6h、12h、24h和48h時間點分成亞組，每亞組6只大鼠。膿毒癥動物模型采用盲腸結扎穿孔致腹腔感染的方法。3%戊巴比妥鈉腹腔注射（40mg／kg）麻醉后，在腹部下方正中切開2cm，逐層分離，探查盲腸，將盲端游離，生理鹽水濕潤后取出，在遠端1／2處結扎，留約直徑0.5cm的線環，用18號針頭貫通腸道穿刺2次，擠出糞便于腹腔內，回納，逐層縫合，術后在皮下注射生理鹽水10ml／只抗休克。對照組開腹翻動盲腸后關腹，皮下補液。治療組術前3d起腹腔注射血必凈2ml／只，q12h，持續至各亞組實驗結束。對照組與模型組給予等量生理鹽水。

1.2 標本采集與組織勻漿制備 制模后于6h、12h、24h、48h再次麻醉后腹主動脈抽血，分離血清，距回盲部5cm處取回腸3cm兩段，一段置于－80℃冰箱凍存用于制備勻漿，一段放入Ep管中，置于液氮中速凍后，保存于－80℃冰箱，留做RNA提取備用。

1.3 ELISA測定血漿PAF、腸組織勻漿 TNFαPAF ELISA檢測試劑盒（上海西唐生物有限公司），TNF－αELISA檢測試劑盒（R＆D Systems），嚴格按試劑盒說明書操作。

1.4 RT－PCR法半定量測定Pafr mRNA水平引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。（1）RNA提取：采用TRIzol法提取大鼠腸組織中RNA。（2）逆轉錄：以RNA作為模板，采用Oligo（dt）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。（3）PCR擴增：反應體系為20μl：SYBR Green Master Mix 10μl、引物上1μl、引物下1μl、cDNA1μl、補滅菌雙蒸水7μl。反應條件：95℃下預變性4min，94℃下變性15s，60℃下退火20s，72℃延伸20s并讀取熒光值，45次循環，循環后設置55～90℃每隔0.3℃讀熒光值生成熔解曲線。

1.5 統計學分析 數據分析采用PASS13.0統計軟件包進行處理，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 模型組大鼠麻醉蘇醒后精神萎靡，隨時間推移出現寒戰、腹圍增加、腹瀉，開腹可見渾濁腹水、腸組織粘連、盲腸結扎端發黑腫脹明顯、表面有膿苔。治療組較同時間點模型組癥狀輕，各時間點大鼠均無死亡發生。

2.2 血漿血小板活化因子（PAF）含量測定 6h時間點開始模型組較對照組血漿PAF含量明顯上升（P＜0.05），并在模型組內隨時間先上升至24h后回落；治療組在6h、12h、24h、48h血漿PAF含量較模型組有明顯下降（P＜0.05）。數據詳見表1。

表1 三組大鼠各時間點血漿PAF值比較（ng／L，±s）

表1 三組大鼠各時間點血漿PAF值比較（ng／L，±s）

注：與對照組各時間點比較，＊P＜0.05，與模型組各時間點比較，＃P＜0.05。

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2.3 腸組織勻漿中腫瘤壞死因子－α（TNF－α）含量測定 6h時間點，三組腸組織TNF－α無明顯變化（P＞0.05）。12h時間點開始模型組較對照組腸組織TNF－α含量明顯上升（P＜0.05），并在模型組內呈先上升至24h后回落；治療組在12h、24h、48h腸組織TNF－α含量較模型組有明顯下降（P＜0.05）。數據詳見表2。

表2 三組大鼠各時間點腸組織勻漿TNF－α值比較（ng／L，±s）

表2 三組大鼠各時間點腸組織勻漿TNF－α值比較（ng／L，±s）

注：與對照組各時間點比較，＊P＜0.05，與模型組各時間點比較，＃P＜0.05。

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2.4 腸組織Pafr基因表達 6h時間點開始模型組較對照組腸組織Pafr基因表達明顯下降（P＜0.05），并呈進行性回升；治療組在6h、12h、24h腸組織Pafr基因表達較模型組明顯升高（P＜0.05），治療組在48h腸組織Pafr基因表達與模型組差異不顯著（P＞0.05），數據詳見表3。

表3 三組大鼠各時間點腸組織勻漿Pafr的mRNA表達百分比（%，±s）

表3 三組大鼠各時間點腸組織勻漿Pafr的mRNA表達百分比（%，±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

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3 討論

目前認為革蘭氏陰性菌感染和內毒素生成、炎癥通路和凝血通路被激活、基因多態性以及信號傳導等機制參與了膿毒癥的發生、發展過程，炎癥介質的失控釋放和炎癥反應紊亂是膿毒癥的本質［2］。本實驗運用CLP法制備膿毒癥模型，由于盲腸的結扎穿孔，造成腹腔的混合細菌感染，接著細菌內毒素移位進入血液循環，導致全身性炎癥反應［4］。結果顯示，模型組與治療組大鼠在制模后有明顯的膿毒癥表現，出現發熱、腹脹、腹瀉等器官功能障礙，模擬了臨床上嚴重膿毒癥的發病過程。

在正常的免疫應答中，各種相關的細胞因子協調和諧，炎癥介質失衡在膿毒癥的病理生理過程中起決定性作用［5～7］。在膿毒癥機體，LPS能促進上皮細胞凋亡、疏松緊密連接促進細菌移位，損傷腸黏膜屏障，并可激發炎癥介質如TNF－α、IL－6等連鎖反應，引起全身器官的損傷［3］。TNF－α是炎癥反應過程中出現最早、最重要的炎性介質，在造成機體損傷的同時激活炎癥效應細胞釋放更多的炎癥因子如IL－1β、IL－6、IL－8等，使炎癥信號產生“級聯放大”作用［8］。本研究中膿毒癥模型組大鼠TNF－α隨時間點逐漸升高至24h后回落。

研究認為PAF在諸多參與胃腸黏膜損害的炎癥介質中可能起到“中心放大”的介導作用，是迄今發現的最強的血小板聚集誘導劑。它通過和細胞膜表面的Pafr結合發揮生物作用，具有使血小板聚集、中性粒細胞聚集、中性粒細胞脫顆粒等作用。本實驗誘發腸組織產生內源性PAF。PAF很可能是內毒素作用的主要效應因子。本實驗中對照組血漿中可檢測到PAF，腸組織中檢測到Pafr，且水平不隨時間推移而變化，提示正常機體內存在PAF及組在6h、12h、24h明顯上升，提示血必凈不是通過下調Pafr的表達來減弱PAF的生物效應，可能是通過抑制PAF的生成，或是抑制PAF與其受體的結合來減弱PAF的生物效應，從而抑制白細胞活化和其他炎癥細胞的釋放，最終達到保護微循環的功能。Pafr的表達。模型組大鼠血漿PAF和腸組織Pafr的表達是動態變化的。PAF明顯高于對照組且隨時間點先升高后回落，與腸組織中TNF－α的表達一致，提示二者參與了膿毒癥的發生發展。

本實驗同時從受體基因表達角度觀察膿毒癥時大鼠腸Pafr基因表達的情況。模型組與對照組在相同時間點比較，6h模型組的Pafr水平顯著低于對照組，后各時間點逐漸回升，說明模型組腸組織的Pafr表達在膿毒癥早期即降低，這與此前有學者在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中Pafr表達降低是一致的。由于本實驗未在膿毒癥早早期設時間點觀測，因此無法了解到Pafr表達在何時間點開始下降。本實驗中模型組Pafr先下降后逐漸回升，與PAF的表達趨勢相反，提示內源性的PAF升高與Pafr表達水平下降可能屬于一種反應性負反饋調節。同時實驗結果顯示PAF在24h處達高峰，而其受體在6h處達低值，峰值的不一致性提示Pafr的表達不是受PAF單因素影響，是受多種機制調控的綜合作用。由于本實驗采用大鼠膿毒癥模型無法精確分析Pafr表達變化的影響因素，只能從整體上對該模型條件下Pafr表達變化作出評價，但其結果更能反映生物體的實際情況，可為以后的深入研究提供思路。

血必凈注射液是王今達教授以“細菌、內毒素、炎癥介質并治”的理論為指導，反復篩選精煉出的靜脈制劑。現代藥理研究證明，活血化淤能改善微循環，減少血小板黏附和聚集，保護血管內皮細胞，減少炎性滲出，使抗炎和促炎反應趨向平衡，從而有效減少致炎因子對機體的損傷［9］。本實驗用血必凈干預治療膿毒癥大鼠后，PAF、TNF－α指標較模型組降低，提示膿毒癥時血必凈能有效拮抗內毒素，抑制炎癥因子的釋放，保護血管內皮細胞，從而發揮對膿毒癥腸道的保護作用。治療組的Pafr表達較模型

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