核桃乳(露)飲品中花生、大豆成分的PCR檢測方法

魏曉璐，黃 鑫，馮 悅，張阿梅，夏雪山，劉 麗

(昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明650500)

核桃主要由脂肪和蛋白質組成［1］，核桃蛋白因具有很高的營養價值而被越來越多的應用到食品生產中。核桃乳(露)飲料憑借其純天然的植物蛋白原材料、不失核桃仁原有營養成份、增強大腦記憶功能［2］等特點為大眾所喜愛。不法商家為謀取私利，采用價格低廉的花生或大豆為原材料仿造核桃乳(露)飲料并以低價爭搶市場。這種食品摻假行為嚴重侵害了消費者的合法權益，不僅欺騙了消費者，也會危害對花生和大豆過敏的消費者。現行植物蛋白飲料衛生標準(GB 16322－2003)注明以核桃仁以外的原料制成的飲品不符合核桃乳(露)定義標準［3］。植物蛋白飲料－核桃乳(露)執行標準(QB/T 2301－1997)以物理和化學方法對核桃乳(露)的感官、凈含量和各種理化指標進行檢測［4］，但無法對其中是否摻入其他植物蛋白做出判斷。為保證核桃乳(露)飲品質量和保護消費者權益，有必要建立檢測核桃乳(露)飲品中摻雜其他植物蛋白的方法。

目前國內外對食品中植物成分殘留以及植物蛋白的檢測研究主要集中在ELISA、普通PCR和實時熒光定量PCR等方面［5－11］，在食品鑒偽相關文獻報道［12－18］中，沒有對核桃乳(露)中摻入花生或大豆進行快速鑒別的有效方法。本研究針對花生特異性過敏基因Arah 1以及大豆特異性過敏基因Gly m Bd28 K設計引物，建立了核桃乳(露)中花生、大豆成分的PCR檢測方法。旨在為核桃乳(露)中摻入大豆、花生成分的檢測提供快速、簡便、準確的方法依據，為保護消費者權益、規范保健食品研制和生產經營提供有力的技術支持和技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃大豆、青大豆、黑大豆、黑小豆、扁豆、綠豆、蠶豆、白蕓豆、紅蕓豆、豌豆、麻豇豆、豇豆、紅小豆、赤豆、腰果、核桃、花生、燕麥、香蕉、白芝麻、榛子、碧根果、蘋果、開心果;瓜子;黑芝麻;杏仁;松子市售不同品牌核桃乳(露)飲品22種 購自當地超市。

臺式高速冷凍離心機 購自德國Eppendorf公司;PCR儀 購自美國Applied Biosystems公司;電泳儀 購自美國Biorad公司;凝膠成像儀 購自美國UVP公司;500bp ladder DNA marker、2000bp ladder DNA marker 購自上海生工生物工程有限公司;2×Prem ix Taq 購自TAKARA生物有限公司;離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號:DP305) 購自天根公司。

表1 PCR引物序列Table1 Sequence of PCR primer

表2 PCR擴增反應條件Table2 PCR reaction condition

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取 固體樣品經液氮研磨成粉末后取100mg，液體樣品經冷凍干燥后取粉末100mg，分別加入1.5m L離心管中。使用天根公司離心柱型植物基因組提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 引物設計 根據不同物種具有各自特異的基因，從Genbank數據庫下載花生過敏基因(Arah 1)序列、大豆過敏基因(Gly m Bd28 K)序列。通過Mega軟件對序列進行比對，利用Oligo軟件，設計一對花生特異性引物Arah 1－F/R、一對大豆特異性引物Bd 28K－F/R。植物通用引物CP 03、核桃特異性引物WAL－F/R參照文獻［5］。本實驗所有引物序列見表1。引物委托華大基因有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增及產物檢測 PCR擴增總體積為25μL，反應體系如下:12.5μL 2×Prem ix Taq (TaKaRa)、0.5μL引物(上下游各0.5μL)、1.0μL模板，補雙蒸水到25μL。PCR擴增反應條件見表2。

取6μL PCR產物，在已加入溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠和1×TAE緩沖液中電泳20min(120V)。以500bp ladder DNA maker或2000bp ladder DNA maker作為分子量對照，于凝膠成像儀下觀察結果。

2 結果與分析

2.1 核桃乳(露)中DNA提取效率

核桃乳(露)中的DNA經過高溫、高壓、滅菌等多道加工工藝，很難直接檢測出DNA提取是否成功。而通過檢測植物中葉綠體DNA片段，可以判定DNA是否符合PCR擴增標準，從而避免檢測結果的假陰性。

本研究采用文獻報道的植物CP 03通用引物［5］，對各種品牌核桃乳(露)中DNA的提取質量和提取效率進行了PCR檢測。擴增結果表明:除陰性對照外，被檢測的所有樣品均能擴增出123bp片段大小的條帶，如圖1。說明所有樣品DNA均符合PCR擴增的要求。

圖1 CP 03對不同核桃乳(露)樣品DNA擴增的結果Fig.1 The PCR result of primer CP 03 in differentwalnutmilk materials

2.2 引物的特異性

以市面上一些常見堅果、水果與大豆、花生、核桃的DNA為模板，分別用Arah1、Bd28 K引物進行PCR擴增。擴增結果表明:Arah 1引物僅對花生DNA擴增陽性，如圖2;Bd28 K引物僅對大豆DNA擴增陽性，如圖3、圖4。

2.3 檢測方法的靈敏度

以花生DNA為標準添加品，按比例添加至核桃DNA中，獲得花生含量分別為10%、1%、0.1%、0.01%的系列稀釋品，Arah1引物PCR擴增結果如圖5。可見隨著花生成分濃度的降低，條帶逐漸減弱，Arah 1引物最低檢測限達到1%。大豆引物靈敏度檢測方法為，以大豆DNA為標準添加品，按上述方法進行稀釋。可見Bd28 K引物最低檢測限達到0.1%，PCR結果如圖6。

2.4 核桃乳(露)中花生、大豆成分的檢測

在對所有核桃乳(露)樣品進行了植物成分DNA檢測后(圖1)，分別進行了核桃、花生、大豆成分的PCR擴增檢測。

圖2 Arah 1引物對不同植物DNA擴增的結果Fig.2 The specificity test result of primer Arah 1 in different plants

圖3 Bd28 K引物對常見豆科植物DNA擴增的結果Fig.3 The specificity test result of primer Bd28 K in common leguminosae

圖4 Bd28 K引物對常見非豆科植物DNA擴增的結果Fig.4 The specificity test result of primer Bd28 K in non－leguminosae plants

結果表明:有四種樣品(5、6、7、21)未擴增出核桃目的片段，如圖7。但用植物通用引物鑒定飲品DNA質量時結果呈陽性，說明已提取出適合PCR擴增的DNA，可能由于其核桃成分含量較低，低于檢測靈敏度以下，或根本不含核桃成分DNA所至。

圖5 Arah 1引物靈敏度檢測結果Fig.5 The sensitivity test of primer Arah 1

圖6 Bd28 K引物靈敏度檢測結果Fig.6 The sensitivity test of primer Bd28 K

圖7 不同核桃乳(露)樣品中核桃成分檢測結果Fig.7 Detection of walnut in differentwalnutmilk materials

在所有被檢測的22種核桃乳(露)中，有4種(樣品1、5、18、21)標明含有花生成分。4種標注含有花生成分的樣品均能擴增出花生目的條帶，與產品中所標識的成分完全一致。另有3種(樣品8、12、14)未標明含花生成分的樣品也擴增出花生目的條帶，說明也含有花生成分，為核桃與花生的混合飲品，與產品中所標識的成分不符，表明摻假，如圖8。

在所有被檢測的22種核桃乳(露)中，有1種(樣品11)標明含有大豆成分，但未擴增出大豆目的條帶，可能不含大豆成分或含量較少。另2種(樣品1、22)未標注含有大豆成分的樣品也擴增出大豆目的條帶，說明含有大豆成分，為核桃與大豆的混合飲品，與產品中所標識的成分不符，表明摻假，如圖9。

圖8 不同核桃乳(露)樣品中花生成分檢測結果Fig.8 Detection of peanut in differentwalnutmilk materials

圖9 不同核桃乳(露)樣品中大豆成分檢測結果Fig.9 Detection of soybean in differentwalnutmilk materials

3 結論與討論

核桃乳(露)在加工過程中經過高溫加熱等工藝，可能導致大量蛋白質變性，使得蛋白水平的檢測困難且靈敏度不高。但PCR技術具有高效、靈敏、操作簡便的優點，在加工食品尤其是深加工食品的有效成分鑒定方面具有重要作用［19］，它檢測的對象是比蛋白質穩定的DNA，在深加工食品中仍有DNA的存在。而且PCR方法較ELISA方法更為準確，同時避免了對大量抗體的需求。因此，PCR檢測法更適用于深加工食品的檢測［14，20］。

在所有被檢測的22種核桃乳(露)中有3種未標明含有花生的樣品檢測出花生成分、2種未標明含有大豆的樣品檢測出大豆成分，與產品標識不符。有2種品牌核桃乳(露)未檢測到原材料核桃成分，可見被其他植物成分取代。這些摻假行為損害了消費者的利益，擾亂了飲品市場，因此，建立快速、靈敏的核桃乳(露)中摻入花生、大豆成分的檢測方法，不但能可靠鑒別核桃乳(露)中的花生、大豆成分，同時也可將此方法作為核桃乳(露)飲品中其他植物源成分檢測的依據。本研究通過對植物葉綠體基因的檢測來判斷是否提取出DNA，從而可有效防止假陰性結果的發生，保證檢測結果的準確性和可靠性。研究結果表明該方法提取的DNA效率高、純度好，Arah 1和Bd28 K引物靈敏度分別達1%和0.1%，適于PCR擴增。可作為核桃乳(露)中摻入花生、大豆成分檢測的有效方法，也可為其他與食品鑒偽相關的方法研究提供可靠參考依據。

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