樹脂法分離純化山楂黃酮

孫協軍，李秀霞，勵建榮，劉雪飛，李穎暢，呂艷芳

（渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心”，遼寧錦州121013）

北山楂是薔薇科（Rosaceace）山楂屬（Crataegus L.）植物山里紅（Crataegus pinnatifida Bunge var.Major N.E.）的果實[1]。北山楂果樹在我國北方地區廣泛栽培，黃酮類化合物是北山楂中主要的生物活性成分，蘆丁、金絲桃苷和槲皮素等是北山楂中重要的槲皮素類黃酮化合物[2]，黃酮類化合物具有降血脂[3]、降血糖[4]、預防肝損傷[5]、抗氧化[6]及提高機體免疫力[7]等生理活性，是山楂果實及葉片中主要的生物活性成分。目前提取黃酮的方法主要是以不同體積分數乙醇為溶劑的浸提法[8]，所得粗提物含有其他醇溶性雜質，山楂作為一種藥食兩用的中藥材，隨著中藥材市場不斷國際化，山楂中主要黃酮類化合物的分離和應用會顯得尤為重要。大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結構和選擇性吸附功能的高分子材料，目前已廣泛應用于天然黃酮類化合物的分離和純化中，已報道在山楂黃酮純化中效果較好的大孔樹脂型號有HZ-818[9]、D101[10-12]、DM 301[13]、AB-8[13]、SP825[13]、X-5[14]、D301[15]、FL-3[16]、ADS-8[17]和FL-2[18]等，為進一步從北山楂中純化出較高含量的蘆丁、金絲桃苷和槲皮素3種黃酮類化合物，本文考察了以上報道中使用過的10種大孔樹脂的純化效果，為山楂中蘆丁、槲皮素和金絲桃苷的進一步開發利用提供樹脂純化技術方面的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山楂 市售，產地遼西地區；蘆丁和槲皮素標準品 純度＞97，購于中國藥品生物制品檢定所；金絲桃苷標準品 純度＞98.5%，購于寶雞市辰光生物科技有限公司；高效液相色譜檢測所用試劑 均為色譜純；水 為超純水；其他試劑 為分析純；HZ-818大孔樹脂 上海華震科技有限公司；D10l、FL-2、X-5和AB-8大孔樹脂 天津南開樹脂廠；D301和DM 301大孔樹脂 天津農藥股份有限公司樹脂分公司；SP825大孔樹脂日本三菱化學公司；FL-3大孔樹脂 天津歐瑞生物科技有限公司；ADS-8大孔樹脂天津南開和成科技有限公司。

P680型高效液相色譜儀 美國戴安公司；FA2004型電子天平、RE-2000型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環水真空泵 上海申光儀器有限公司；KQ-400KDE型超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；HL-2恒流泵、BSZ-100型自動部分收集器 上海青浦瀘西儀器廠；TGL-16型高速離心機 金壇恒豐儀器制造有限公司；PS02-AD-DI型超純水機 上海訊輝環保科技有限公司；GT2-M真空冷凍干燥機 德國SRK系統技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜檢測條件及標準曲線制備[2]DevelosilC30色譜柱；流動相：A相為乙腈，B相為0.4%磷酸水溶液，梯度洗脫，80%B～60.5%B（0～26min），80%B平衡4m in后進下一個樣品；流速1m L/m in；柱溫40℃；進樣20μL；檢測波長：360nm。

各取蘆丁、金絲桃苷和槲皮素標準品48、15、4.5mg，甲醇溶解并分別定容至10m L，得到濃度分別為4.8、1.5、0.45mg/m L的3種標準品貯備液，分別吸取同體積各標準貯備液，稀釋為6個濃度梯度的標準使用溶液，濃度分別為（以蘆丁為例）：0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16mg/m L。

1.2.2 山楂黃酮水溶液的制備 選擇整齊度良好的新鮮山楂用自來水清洗后去除果核，帶皮果肉部分在50℃熱風烘干后粉碎成細果粉，全部過40目分樣篩后真空封裝，冷藏備用。稱取適量山楂果粉于回流裝置的燒瓶中，加入適量體積分數80%乙醇，70℃回流提取2h后減壓濃縮除去大部分乙醇，12000r/m in離心5m in，取上清液備用，0.45μm膜過濾后，HPLC測定蘆丁、金絲桃苷和槲皮素3種黃酮總濃度。

1.2.3 大孔樹脂預處理 各取未經處理的HZ-818、D101、FL-2、X-5、AB-8、D301、DM 30、SP825、FL-3和ADS-8這10種大孔樹脂干樹脂各10g，參照董恒穎[17]的前處理方法并稍作修改，將樹脂在體積分數95%乙醇溶液中浸泡24h，充分膨脹之后清洗至無白色渾濁，用去離子水洗去乙醇，將大孔樹脂依次用2倍柱體積（BV）5%NaOH溶液、2BV去離子水、2BV 10%的鹽酸洗滌，最后用去離子水洗至中性備用。

1.2.4 靜態吸附方法 分別加入1.2.2中制備的山楂水溶液30m L于100m L錐形瓶中，以150r/m in速度于振蕩器內振搖2h，靜置過夜。然后，分別取各樹脂吸附后的溶液1m L，12000r/m in離心5m in，取上清液0.45μm濾膜過濾后HPLC檢測3種黃酮總含量，計算各種樹脂對山楂總黃酮的吸附率。

吸附量和吸附率按以下公式計算。

1.2.5 靜態解吸方法 將靜態吸附的樹脂過濾抽干，加入30m L體積分數為75%乙醇解吸，以150r/m in速度于振蕩器內振搖2h，靜置過夜。分別取各解吸液1m L，12000r/min離心5m in，取上清液0.45μm濾膜過濾，HPLC檢測3種黃酮總含量，計算各種樹脂對3種黃酮的解吸率。

1.2.6 動態吸附方法 取靜態吸附優選出的2種干樹脂各40g，處理方法同靜態吸附干樹脂處理法。裝于2cm×20cm的層析柱內，加入1.2.2中處理得到的山楂黃酮提取液樣品于柱頂，以2BV/h的流速進行動態吸附，按樹脂床體積收集流出液，0.45μm濾膜過濾，HPLC檢測3種黃酮總含量，計算總黃酮質量濃度，繪制各樹脂的泄漏曲線。

1.2.7 動態解吸方法 按照靜態吸附干樹脂處理法處理好D101和FL-2樹脂，各取40g，分別裝柱于2cm×20cm的柱內，將180m L山楂溶液以2BV/h的流速進行吸附至飽和，先用5BV去離子水以2BV/h的流速洗脫，再以75%乙醇以2BV/h的流速洗脫，按樹脂床體積收集，0.45μm濾膜過濾，HPLC檢測3種黃酮總含量，計算乙醇洗脫液中總黃酮的質量濃度。

1.2.8 動態解吸單因素實驗 各稱取干重為30g的D101樹脂，按照1.2.3前處理方法處理后，濕法裝柱（2cm×20cm），樹脂床體積約為15m L，固定洗脫液流速為2BV/h，先以5BV去離子水洗脫，再用75%乙醇洗脫，收集洗脫液至50m L，分別考察山楂黃酮提取液稀釋倍數、上樣液pH、吸附速率、上樣量、乙醇體積分數、洗脫液流速對吸附解吸效果的影響，具體操作如下：

1.2.8.1 山楂黃酮提取液稀釋倍數對解吸率的影響取1.2.2制備的山楂黃酮水溶液5m L，分別加水稀釋0、5、10、15和20倍上樹脂柱，以2BV/h的流速進行吸附后，先以5BV水洗脫，再用75%乙醇洗脫，收集洗脫液至50m L，0.45μm濾膜過濾，HPLC檢測3種黃酮總含量，計算解吸率。

1.2.8.2 上樣液pH對解吸率的影響 取1.2.2制備的山楂黃酮水溶液5m L，用1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH調pH 1～2、3～4、5～6、7～8和9～10，上樹脂柱，以2BV/h的流速進行吸附后，先以5BV水洗脫，再用體積分數75%乙醇洗脫，收集洗脫液至50m L，0.45μm濾膜過濾，HPLC檢測3種黃酮總含量，計算解吸率。

1.2.8.3 上樣流速對解吸率的影響 取1.2.2制備的山楂黃酮水溶液5m L，上樹脂柱，分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速進行吸附，以5BV水洗脫后，再用體積分數75%乙醇以2BV/h的速度洗脫，收集洗脫液至50m L，0.45μm濾膜過濾，HPLC檢測3種黃酮總含量，計算解吸率。

1.2.8.4 乙醇體積分數對解吸率的影響 取1.2.2制備的山楂黃酮水溶液5m L，以1BV/h的流速進行吸附，再以5BV的水洗脫后，分別用體積分數為10%、30%、50%、75%和90%乙醇洗脫，收集洗脫液至50m L，0.45μm濾膜過濾，HPLC檢測3種黃酮總含量，然后計算總黃酮含量。

1.2.8.5 解吸流速對解吸率的影響 取1.2.2制備的山楂黃酮水溶液5m L，以1BV/h的流速吸附，再以5BV水洗脫，75%乙醇洗脫，洗脫液流速分別為1、2、3、4、5BV/h收集洗脫液至50m L，0.45μm濾膜過濾，HPLC檢測3種黃酮總含量，計算解吸率。

1.2.8.6 上樣量對解吸率的影響 取1.2.2制備的山楂黃酮水溶液上樹脂柱，以1BV/h的流速進行吸附，按樹脂床體積數收集流出液，0.45μm濾膜過濾，HPLC檢測3種黃酮總含量。

1.2.8.7 洗脫終點的確定 將吸附飽和的樹脂用體積分數75%乙醇，以5BV/h的速度洗脫，按樹脂床體積收集洗脫液10m L，0.45μm濾膜過濾，HPLC檢測3種黃酮總含量，確定洗脫終點。

1.2.9 純化產物中山楂黃酮含量分析 取1.2.2制備的山楂黃酮水溶液5m L上樹脂柱，按照1.2.8中優化出的條件進行樹脂純化，收集洗脫液，減壓除醇，-78℃速凍后于-50℃真空凍干成粉末，準確稱取一定量凍干粉末，精確到0.0001g，定容于25m L容量瓶中，HPLC檢測黃酮含量，平行測定3次，計算3種黃酮總含量。

2 結果與分析

2.1 HPLC分離結果和標準曲線的建立[2]

所配制的標準溶液經0.45μm膜過濾后分別進樣，每個濃度進樣3次，黃酮混合標準溶液及山楂提取液的液相色譜圖見圖1（A）和圖1（B），以峰面積（mAU）為橫坐標，3種黃酮濃度平均值（mg/m L）為縱坐標，得到3條標準曲線，標準曲線的回歸方程為：蘆丁，Y=538.31X-0.3226（r2=0.9999）；金絲桃苷，Y= 828.86X（r2=0.9996）；槲皮素，Y=550.85X+0.044（r2= 0.9997）。測得蘆丁、金絲桃苷和槲皮素3種黃酮總濃度為18.75mg/m L。

2.2 靜態吸附與解吸實驗結果

不同大孔樹脂對山楂黃酮提取液吸附和解吸的效果見圖2所示，由圖2可以看出，幾種大孔樹脂中，D101和FL-2樹脂對山楂黃酮的吸附率和解吸率都大于85%，吸附率高低的順序為：D101＞FL-2＞FL-3＞D301＞AB-8＞X-5＞SP825＞DM 301＞ADS-8＞HZ-818，解吸率高低順序為：D101＞FL-2＞FL-3＞X-5＞AB-8＞SP825＞D301＞ADS-8＞HZ-818＞DM 301，因此，選擇其中對山楂黃酮吸附和解吸能力較強的D101和FL-2樹脂進行進一步的動態吸附和解吸實驗。

圖1 黃酮混合標準溶液（A）和山楂黃酮提取液（B）色譜圖Fig.1 Chromatogram of flavonoidmixed standard solution（A）and hawthorn flavones extrac（tB）

圖2 不同大孔樹脂對山楂黃酮的吸附率和解吸率Fig.2 Adsorption and desorption ratio of differentmacroporous resin for hawthorn flavones

2.3 D101和FL-2動態吸附和解吸實驗結果

圖3 D101和FL-2樹脂的吸附泄漏曲線Fig.3 Leakage adsorption curve of D101 and FL-2 resin

D101型大孔樹脂和FL-2型大孔樹脂對山楂黃酮的動態吸附和解吸曲線見圖3和圖4所示，從圖4可以看出，達到吸附飽和時，D101樹脂吸附的山楂黃酮濃度高于FL-2樹脂，而2種樹脂的解吸曲線沒有多大區別，在用4倍柱床體積的洗脫液洗脫后，基本解吸完全。

圖4 D101和FL-2樹脂的動態解吸曲線Fig.4 Dynamic desorption curve of D101和FL-2 resin

2.4 山楂黃酮提取液稀釋倍數的影響

山楂黃酮提取液對解吸率影響的測定結果見圖5，在山楂黃酮稀釋倍數在10倍（黃酮濃度1.875mg/m L）以下時，隨著稀釋倍數的增加，黃酮吸附量和解吸率有提高的趨勢，但提高的幅度較小，而黃酮稀釋倍數超過10倍以后，吸附效率降低。黃酮稀釋的增加提高了后繼處理的難度，因此，山楂黃酮溶液可以不必進行稀釋。

圖5 山楂黃酮提取液稀釋倍數對D101吸附樹脂吸附效果的影響Fig.5 Effectof Hawthorn flavone extract dilution ratio on the absorption effect of the adsorption efficiency of D101 resin

2.5 pH對山楂黃酮吸附和解吸效果的影響

圖6 料液pH對D101樹脂吸附效果的影響Fig.6 Effect ofmaterial liquid pH on adsorption efficiency of D101 resin

上樣液pH對解吸率影響的測定結果見圖6，當山楂黃酮溶液的pH為1～4時，山楂黃酮吸附量相對較高，這可能是由于黃酮類化合物中含有酚羥基，在酸性條件下與樹脂間的作用力增強的緣故[19]，而pH3～4的料液條件比pH 1～2的條件溫和，因此，選擇pH 3～4進行樹脂純化實驗。

2.6 上樣流速對山楂黃酮吸附和解吸效果的影響

上樣流速對山楂黃酮吸附和解吸效果的影響見圖7所示，由圖7可知，由于實驗中所選擇的的上樣流速比較低，在所選擇的0.5～5BV/h范圍內，相對低的上樣流速有助于黃酮的吸附和解吸，可能是較慢的流速增加了黃酮和樹脂接觸的時間，提高了樹脂的吸附效率，但過慢的流速增加了吸附時間，因此，綜合考慮以上因素，選擇上樣流速為1BV/h進行樹脂純化實驗。

圖7 上樣流速對D101樹脂吸附效果的影響Fig.7 Effectof sample flow rate on adsorption efficiency of D101 resin

2.7 乙醇體積分數對吸附和解吸效果的影響

乙醇體積分數對黃酮解吸效果的影響見圖8，當乙醇體積分數超過50%后，解吸率均達到70%以上，這與山楂黃酮的組成有關，本實驗所用山楂果實主要含有蘆丁和金絲桃苷2種黃酮類物質[2]，這類黃酮在70%～80%乙醇溶液中溶解性較好[8]，在本實驗中，當乙醇體積分數從50%升高到90%時，山楂黃酮的吸附量和解吸率的增加幅度不大，考慮到山楂中蘆丁和金絲桃苷的溶解度原因，選用75%的乙醇進行洗脫。

圖8 乙醇體積分數對D101樹脂解吸率的影響Fig.8 Effect of ethanol volume fraction on desorption ratio of D101 resin

2.8 解吸流速對解吸效果的影響

解吸流速對解吸效果的影響如圖9所示，在解吸流速高于2BV/h后，黃酮解吸率隨著洗脫液流速增加而增加，超過3BV/h時，解吸率增加趨勢變緩，所以選擇解吸流速為3BV/h為宜。

圖9 解吸流速對解吸效果的影響Fig.9 Effectof desorption rate on desorption efficiency

2.9 上樣量對山楂黃酮吸附和解吸效果的影響

上樣量對山楂黃酮吸附和解吸效果的影響如圖10所示，當上樣量超過3BV時，解吸液中黃酮濃度開始增加，而當上樣量超過4BV后，解吸液中黃酮的濃度顯著增加，說明此時大孔樹脂對山楂黃酮的吸附趨近于飽和，之后隨著上樣量的增加，洗脫液中黃酮濃度緩慢增加，在6BV時達到吸附飽和。

圖10 上樣量對D101樹脂吸附效果的影響Fig.1 0 Effectof sample volume on absorption efficiency of D101 resin

2.10 洗脫終點的確定

洗脫劑用量對山楂黃酮洗脫結果的影響見圖11，隨著洗脫劑用量的增加，洗脫液中黃酮濃度逐漸增加，在洗脫劑為1.5BV時達到最高點，當洗脫液用量為3BV時，山楂總黃酮基本洗脫完全。

2.11 純化產物中總黃酮濃度分析

山楂黃酮提取液在優化條件（上樣液濃度18.75mg/m L、pH 3～4、上樣流速1BV/h、洗脫液乙醇體積分數75%、洗脫液流速1BV/h）下進行純化，結果見表1，純化產物中總黃酮純度為65.47%，回收率為86.82%，且具有良好的重復性。

圖11 山楂黃酮的解吸曲線Fig.1 1 Desorption curve of hawthorn flavonoids

3 結論

3.1 比較了10種大孔吸附樹脂對山楂黃酮的靜態吸附和解吸效果，從中選出吸附效果較好樹脂，并進一步通過動態吸附過程分析確定D101是最適合于山楂黃酮的吸附。

3.2 D101樹脂吸附山楂黃酮的最佳工藝參數為：上樣液濃度18.75mg/m L、pH3～4、上樣流速1BV/h、洗脫液乙醇體積分數75%、洗脫液流速1BV/h；上樣量達到6BV時，樹脂達到吸附平衡，當洗脫液用量為3BV時，達到洗脫終點。

3.3 經D101樹脂在最佳工藝條件下純化后，山楂中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的總純度達到65.47%，回收率為86.22%。

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表1 純化產物中山楂黃酮濃度Table1 Hawthorn flavone concentration of purified product

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