靈芝菌絲體中靈芝酸T、R和S的H P L C測定方法的建立和應用

趙 娜，馮 娜，賈 薇，馮 杰，劉艷芳，張勁松，*

（1.國家食用菌工程技術研究中心，農業部南方食用菌資源利用重點實驗室，上海市農業遺傳育種重點開放實驗室，上海市農業科學院食用菌研究所，上海201403；2.上海海洋大學食品科學與工程，上海201306）

靈芝（Ganoderma lucidum）俗稱靈芝草，古稱瑞草、仙草、萬年覃等，是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，具有很高的藥用價值[1]，現代的研究證實其有抗腫瘤、保肝、降血壓、降血糖等生物活性，三萜是靈芝產生抗腫瘤、保肝等生物活性的主要藥用成分[2-3]。目前，靈芝相關的保健品和藥品多以靈芝子實體為原料，但因其栽培周期長，靈芝中的活性成分的種類和含量如三萜易受栽培環境的變化而變化，導致產品質量難以控制。而利用發酵的方法制備靈芝的菌絲體作為靈芝產品開發的原料，具有生產周期短，質量容易控制，易于工業化生產等優點，越來越得到業界的重視。我們的前期研究發現靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R是靈芝菌絲體中主要的三萜成分，其具有抗肝癌[4]、抗子宮頸癌[5]、抗前列腺癌的作用。因此建立靈芝菌絲體中主要三萜成分的測定方法對開發靈芝菌絲體的產品就至關重要。靈芝子實體中三萜類化合物的液相色譜分析已有報道[6-7]，但涉及菌絲體中三萜成分檢測方法和質量控制的很少有報道。本研究以已報道的關于靈芝酸的相關檢測方法為基礎[8-10]，建立了HPLC法對靈芝菌絲體中靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R進行同時測定的方法，為快速準確的檢測靈芝發酵菌絲體中靈芝酸含量提供了技術保證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝酸T、S、R標準品 純度＞98%，上海市農業科學院食用菌所深加工技術和發酵工程研究室；赤芝0125菌絲體、靈芝119菌絲體、靈芝G0023菌絲體中國微生物菌種保藏管理委員會農業微生物中心上海食用菌分中心；水 超純水；甲醇 色譜純；冰醋酸 分析純。

Waters Acquity HPLCTM型高效液相色譜儀 美國Waters公司；KQ-600B型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；超純水器 ELGA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 YMC C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相0.5%冰醋酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～20min，85%B→100%B；20～30min，100%B），流速為1mL/min；檢測波長為245nm；柱溫控制在30℃；進樣量為10μL。

1.2.2 樣品前處理條件選擇

1.2.2.1 提取溶劑的選擇 精密稱取樣品（G0023）粉末0.5g，分別加入95%乙醇、甲醇、氯仿各25mL，超聲2h，放冷，過濾，補足損失的溶劑，搖勻，濾液用0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.2.2 浸提和超聲的選擇 精密稱取樣品（G0023）粉末0.5g，加入25mL甲醇，分別浸提14h、超聲1h、超聲2h、超聲3h、超聲4h，放冷，過濾補足損失的溶劑，搖勻，濾液用0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 標準液的配制與曲線繪制 精密稱定靈芝酸T 10.67mg、靈芝酸S 10.59mg、靈芝酸R 10.65mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R對照品儲備液。分別吸取等量的靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的對照品儲備液，混合制成標準混合母液。然后分別稀釋成5個濃度梯度，用孔徑0.22μm濾膜過濾，置于進樣瓶中。按照上述的色譜條件獲得色譜圖后，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，制作標準曲線，求出回歸方程。

1.2.3.2 精密度實驗 取混合對照品連續進樣6次，測定靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R峰面積，并計算峰面積的RSD值。

1.2.3.3 重復性實驗 精密稱取靈芝樣品（G0023）6份，按確定的方法制備供試溶液，測定靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的含量，并計算含量的RSD值。

1.2.3.4 穩定性實驗 精密稱取靈芝樣品（G0023）1份，按確定方法制備供試溶液，分別在制備后0、5、10、15、20、25h進樣測定靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的峰面積，并計算峰面積的RSD值。

1.2.3.5 加樣回收率實驗 取已知含量的靈芝樣品（G0023）9份，精密稱取各約0.1g，按高、中、低3個濃度，各精密加入一定量的靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R對照品3份，按照確定方法制備供試溶液，測定靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的含量，并計算含量的RSD值。1.2.3.6 樣品分析 在相同的液相色譜條件下，分別將對照品溶液和供試菌絲體的樣品溶液注入高效液相色譜儀中，用外標法計算含量，根據樣品對應的峰面積和標準曲線，計算各樣品中靈芝酸T、靈芝酸R、靈芝酸S的含量。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的確定

2.1.1 提取溶劑的比較 圖1的結果表明，三種提取方法的三萜圖譜含有的三萜種類相同，但相同成分的峰高有差異。

表1 不同提取劑提取率的比較Table 1 Comparison of ganderic acids’extraction ratio by different extractants

表1表明，通過SAS 8.2軟件組間差異分析發現結合靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R三個指標來看，氯仿、甲醇、95%乙醇三種提取劑間，Wilks’Landa統計量F=8.39，p=0.0042＜0.01，表明三者存在極顯著差異；氯仿和甲醇組間，F=24.36，p=0.005＜0.01，說明兩者存在顯著差異；氯仿和95%乙醇組間，F=12.73，p=0.016＜0.05，說明兩者存在顯著差異；甲醇和95%乙醇組間，F=4.34，p=0.095＞0.05，說明兩者不存在差異。其中氯仿的提取效率最差，目標物質提取量均最低，甲醇和95%乙醇譜圖相似度高，甲醇的提取效果更好，目標物質均達到最高提取量，因此本研究確定采用甲醇作為提取溶劑。

2.1.2 超聲和浸提提取方式的比較 結合靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R三個指標來看，經分析發現浸提和超聲各組組間的Wilks’Landa統計量F=4.34，p=0.0015＜0.01，表明各組間存在極顯著差異。浸提14h組與超聲1、2、3、4h組均存在顯著性差異，但超聲1、2、3、4h組之間不存在差異很明顯（p＞0.05）。隨著超聲時間的增加，靈芝酸的提取量升高。因超聲的方法耗時短、提取的得率高，因此確定超聲2h為最佳提取方式。

2.2 色譜條件的確定

全波長掃描發現靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R在245nm有最大吸收峰，當檢測波長設為245nm，流動相為0.5%冰醋酸溶液和甲醇，柱溫為30℃，流速為1mL/min時，靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的保留時間分別為13.5、15.3、19.9min，達到基線分離（見圖2）。用該色譜條件分析G0023上層菌絲體樣品中這三種靈芝酸，發現它們和其他的色譜峰能很好的分開，說明該條件可用于靈芝菌絲體中這三種靈芝酸的檢測（見圖3）。

表2 不同提取方式提取率的比較Table 2 Comparison of GAs’extraction ratio in different extraction ways

圖2 混合對照品的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference substances

圖3 G0023上層菌絲體樣品的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of Ganoderma sample G0023

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線的制作 靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R的不同濃度的標準溶液的濃度和峰面積的標準曲線見圖4。靈芝酸T的線性回歸方程為Y=11106X-68267，r=0.9999；靈芝酸S的線性回歸方程為Y=15521X-51762，r=0.9999；靈芝酸R的線性回歸方程為Y=16736X-37108，r=1.0000。結果表明，靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的測試濃度分別在4.571 ～584.256、5 ～320、4.921 ～629.888μg/mL內呈良好線性關系。

圖4 靈芝酸T（A）、靈芝酸S（B）、靈芝酸R（C）的標準曲線Fig.4 Standard curve of GA-T(（A）、GA-S（B）and GA-R（C）

2.3.2 精密度實驗 取混合對照品連續進樣6次，計算6次測定的峰面積的RSD，結果靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R峰面積的RSD值（n=6）分別為0.93%、1.76%、1.27%（見表3），表明方法的精密度良好。

2.3.3 重復性實驗 取靈芝樣品（G0023）6份進行重復性測試，結果靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R含量的RSD值（n=6）分別為1.31%，1.76%、1.29%（見表4），表明方法的重復性良好。

表3 精密度實驗Table 3 Precision of the measured results

2.3.4 穩定性實驗 把靈芝樣品（G0023）的供試品溶液，分別在制備后0、5、10、15、20、25h進樣測定，發現靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的RSD值（n=6）分別為0.71%、0.66%、1.14%（見表5），結果表明方法的穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率實驗 加樣回收率實驗結果表明靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R特異性良好。平均加樣回收率和RSD值（n=9）分別為99.1%、2.4%，100.6%、1.1%，100.7%、0.9%。

2.3.6 靈芝菌絲體中靈芝酸的含量的測定 利用建立的HPLC方法對不同菌絲體中靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的含量進行測定（見表7）。利用SAS 8.2軟件組間差異分析，結合119上層菌絲、G0023上層菌絲、赤芝0125-1上層菌絲和下層菌絲四個指標來看，靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R三組間，Wilks’Landa統計量F=28.45，p=0.0003＜0.01。說明不同菌株間的靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R的含量差異大，且三者之間的比例也不同，119上層菌絲體靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R之間的比為15∶5∶1，而G0023上層菌絲體為2∶2∶1；說明同一菌株不同發酵部位的菌絲體中靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R的含量差異也很大，且比例也不同，如赤芝0125-1上層菌絲體為6∶2∶1，赤芝0125-1下層菌絲體為2∶1∶1。

表4 重復性實驗Table 4 Reproducibility of the measured results

表5 穩定性實驗Table 5 Stability of the measured results

表6 加樣回收率Table 6 Recoveries for the measured results

表7 不同靈芝菌絲體中靈芝酸的測定結果Table 7 Determination of ganoderic acids in different Ganoderma mycelium samples

3 結論

本研究確定了靈芝菌絲體三萜的提取方法和優化利用C18柱同時檢測靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R的色譜條件，通過精密度、重復性和加樣回收率的考察，表明本研究獲得的HPLC方法符合作為檢測方法的要求，適合靈芝發酵菌絲體中靈芝酸T、靈芝酸S、靈芝酸R的同時定量分析，是一種理想的靈芝菌絲體中三萜的定量分析方法。

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