響應面法優化紫薯蕷中花色苷的提取工藝研究

王澤鋒，石 玲，蘇一蘭，閔 勇

（紅河學院理學院，云南蒙自661199）

紫薯蕷是薯蕷科草本蔓生性植物，其塊根表皮紫褐色，肉乳白色中帶紫點或為全紫色，它富含有淀粉、氨基酸、維生素、皂苷等多種有益于人體健康的營養物質。紫薯蕷具有補肺益腎、補脾養胃等功效，可用于治療脾虛久瀉、慢性腸炎、肺虛咳喘等癥，因而，紫薯蕷是一類極具開發價值的藥膳食品[1-3]。紫薯蕷可食部分及其表皮的色澤均取決于花色苷，花色苷是植物界中分布最廣的色素之一。它除了具有色素的作用，還在抗氧化、抗變異抗腫瘤、減輕肝臟機能障礙、抗高血糖、改善視力、預防和治療心血管疾病等方面具有良好的作用[4-5]。近年來對于花色苷的研究已經成為很多專家和學者研究的熱點，特別是食品安全性問題的不斷發生，允許在食品中使用的合成色素種類大大減少，使各國食品科學家對資源豐富的天然花色苷的應用研究更成了一種趨勢，并在此方面有了很大的研究進展。

目前，有關紫薯蕷花色苷色素提取方面的研究報道很少[6-8]，例如，王哲等[6]采用酸化乙醇法對紫山藥色素進行提取；曾哲靈等[7]采用溶劑回流提取法提取紫山藥中的色素，采用單因素和正交實驗法確定最佳提取工藝條件；倪勤學等[8]同樣采用溶劑提取法對紫山藥色素進行提取；但是對于優化提取工藝條件方面，已有的報道并沒有采用響應曲面法對提取工藝條件進行優化。因此，本實驗通過響應曲面法優化回流提取紫薯蕷花色苷色素的工藝參數，確定其最佳的工藝條件，以檸檬酸水溶液為提取劑，減少了花色苷的降解，同時大大降低了成本，方法簡便可靠，旨在為紫薯蕷花色苷的提取研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫薯蕷 云南省紅河州元陽縣農貿市場；氯化鉀、鹽酸、乙酸鈉、冰乙酸等 上海國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

UV-2000X型紫外-可見分光光度計 上海尤尼科有限公司；FA1004型電子天平、PHS-3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司；N-1100D型旋轉蒸發儀 東京理化；DZF-6050MBE型真空干燥箱 常州諾基儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制

表1 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液的配制（pH3.0～6.0）Table1 Preparation of citric acid-sodium citrate buffer solution（pH3.0～6.0）

pH為0.5～2.0的緩沖溶液：0.1mol/L檸檬酸溶液逐滴加入鹽酸，pH計校正配制。

pH=1.0的緩沖液[8]：準確稱取1.49g KCl用蒸餾水溶解至100m L容量瓶中，配成0.2mol/L的KCl溶液；準確量取1.62m L濃HCl（分析純），用蒸餾水定容至100m L容量瓶中，搖勻得0.2mol/L的HCl溶液，將上述KCl溶液與HCl溶液以體積比25∶67混合，用KCl溶液調pH（1.0±0.1）。

pH=4.5的緩沖液[6]：準確稱取1.64g NaAc用蒸餾水溶解至100m L容量瓶中，配成0.2mol/L的NaAc溶液；取1.14m L冰乙酸用蒸餾水定容至100m L容量瓶中，將二者按體積比1∶1混合。

1.2.2 紫薯蕷花色苷的提取

1.2.2.1 原材料前處理 選用新鮮，無病蟲害，無腐爛的紫薯蕷，用水洗凈，瀝干，切成2～3mm的薄片，于40℃下，（真空度為-80kPa）真空干燥12h，粉碎過40目篩，避光保存。

1.2.2.2 花色苷的提取工藝 工藝流程[7-8]：2.0g紫薯蕷粉末→溶劑回流提取→減壓過濾→定容至100mL。

準確稱取2.0g紫薯蕷粉末，按一定的提取溶劑濃度、料液比、提取時間和提取溫度進行提取，提取液減壓（壓力-0.08MPa）過濾，濾液定容至100m L。

1.2.3 紫薯蕷中花色苷的測定

1.2.3.1 不同溶劑提取實驗 選取8種溶劑：純水、95%乙醇、0.5%鹽酸、0.5%檸檬酸、1.0%檸檬酸、2.0%檸檬酸、3.0%檸檬酸、4.0%檸檬酸，料液比按1∶20，溫度70℃時對紫薯蕷中的花色苷進行回流提取1.0h，提取液減壓過濾，濾液定容至100m L，以蒸餾水為空白，用紫外可見分光光度計對其在400～800nm范圍內進行掃描，得到該溶液的最大吸收波長。

1.2.3.2 測定吸光度時pH的選擇 分別吸取1.0m L（注：取樣量為所測總體積的20%，即不影響緩沖溶液緩沖能力的取樣量最大限）樣品于7個試管中，再分別加入pH為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液9.0m L，平衡90m in后，以去離子水為空白，于520nm波長下測定吸光度。

1.2.3.3 花色苷含量的測定 花色苷發色團結構的轉換是pH的函數，而且起干擾作用的棕褐色（降解）產物的特征光譜不隨pH的改變而變化。結合朗伯-比爾定律可得出，在兩個不同pH下，花色苷溶液的吸光度的差值與花色苷的含量成正比。通過實驗，確定兩個對花色苷吸光度差別最大但是對花色苷穩定的pH。當溶液pH=1.0時，花色苷在510nm處有最大光吸收，而當溶液pH=4.5時，花色苷轉變為無色查爾酮形式，在510nm處無吸收，因此，參考T Fuleki的經驗公式可以用示差法計算溶液中花色苷含量[9-10]。

取待測液1m L，分別用pH1.0和pH4.5的緩沖液定容至10m L，平衡90min后，分別在700nm和510nm下測定兩種溶液的吸光值，每個樣品平行3次。按下式計算花色苷得率。

式中，A=（A510nmpH1.0-A700nmpH1.0）-（A510nmpH4.5-A700nmpH4.5）；ε=矢車菊素-3葡萄糖苷的摩爾消光系數（26900）；MW=矢車菊素-3葡萄糖苷的摩爾質量=449.2g/mol；DF=稀釋倍數；V=最后定容的體積（m L）；Wt=樣品質量（mg）；L=比色皿的厚度（1cm）。

1.2.4 紫薯蕷中花色苷提取的單因素實驗

1.2.4.1 提取溶劑對花色苷得率的影響 按照1.2.2.2的實驗方法，當料液比為1∶20時，以純水、0.5%檸檬酸、0.5%鹽酸、95%乙醇分別為提取溶劑，在溫度70℃時對紫薯蕷中的花色苷進行回流提取1.0h，考察提取溶劑對花色苷得率的影響。

1.2.4.2 檸檬酸濃度對花色苷得率的影響 按照1.2.2.2的實驗方法，當料液比為1∶20時，以0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%的檸檬酸為提取溶劑，在溫度70℃時對紫薯蕷中的花色苷進行回流提取1.0h，考察檸檬酸濃度對花色苷得率的影響。

1.2.4.3 料液比對花色苷得率的影響 按照1.2.2.2的實驗方法，以3.0%的檸檬酸溶液為提取溶劑，在料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g/m L，提取溫度70℃時對紫薯蕷中的花色苷進行回流提取1.0h，考察料液比對花色苷得率的影響。

1.2.4.4 提取溫度對花色苷得率的影響 按照1.2.2.2的實驗方法，以3.0%的檸檬酸溶液為提取溶劑，在料液比為1∶20g/m L，分別在提取溫度為40、50、60、70、80℃時進行回流提取1.0h，考察提取溫度對花色苷得率的影響。

1.2.4.5 提取時間對花色苷得率的影響 按照1.2.2.2的實驗方法，以3.0%的檸檬酸溶液為提取溶劑，在料液比為1∶20g/m L，溫度為70℃時，分別對紫薯蕷進行回流提取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0h，考察提取時間對花色苷得率的影響。

1.2.5 紫薯蕷中花色苷提取Box-Behnken Design（BBD）實驗設計 采用Design-Expert軟件中的BBD響應面進行實驗設計考察，選取檸檬酸濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）四個對花色苷提取效果影響顯著的因素為自變量，每個自變量的低、中、高實驗水平，分別以-1、0、1進行編碼。以花色苷得率（Y）為響應值，對紫薯蕷中花色苷的提取方法進行四因素三水平研究，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行數據處理和回歸分析。具體的實驗因素與水平設計見表2。

表2 BBD響應面因素水平表Table2 Process variables and their levels in four variablesthree levels of response surface design

2 結果與分析

2.1 不同提取溶劑光譜圖

對不同溶劑提取液的吸收光譜進行掃描，結果見圖1。由圖1可以看出，八種溶劑的提取液，其特征峰值的波長差異較小，峰值差異較大，以純水和乙醇做提取溶劑時，最大吸收峰的吸光度值較低，以0.5%的鹽酸和檸檬酸為提取溶劑時，最大吸收峰的波長和吸光度值很接近，隨著提取溶劑酸度的增加，最大吸收峰波長藍移，當采用3.0%的檸檬酸為提取溶劑時，樣品的吸光度值最大為0.615，其波長為520nm，這是花色苷的特征峰（465～560nm）。當采用4.0%的檸檬酸為提取溶劑時，其最大吸收峰所對應的吸光度值反而減小，這主要是因為溶液的酸度過大，某種程度上使花色苷的結構發生了改變[11]。

圖1 紫薯蕷花色苷不同溶劑提取液的紫外光譜圖Fig.1 The UV/Vis spectra of purple yam anthocyanin that extracted with different solvents

2.2 不同pH下的吸光度

圖2表明，紫薯蕷花色苷在pH為1.0，pH為4.5處的吸光度的差是極大的，而在pH為1.0，pH為4.5附近其吸光度變化不大，且pH為1.0時的吸光度明顯大于pH為4.5時的吸光度，這是因為隨著pH的上升，花色苷結構發生變化，被裂解為花色苷基元及糖基兩部分，導致花色苷穩定性下降，因此選定pH為1.0及4.5兩個pH來測定花色苷的吸光度[12]。

圖2 樣品在不同pH下測定的吸光度值Fig.2 Absorbance value of samples under different pH

2.3 紫薯蕷花色苷提取單因素實驗

2.3.1 提取溶劑種類對花色苷得率的影響 考察了不同的提取溶劑對提取效果的影響，由圖3可知，采用0.5%檸檬酸溶液作為提取溶劑提取效果最好，這主要是因為花色苷易溶于極性溶劑水、甲醇、乙醇中，為防止花色苷降解，以提高花色苷得率，常在溶劑中加入少量的無機酸或有機弱酸降低提取液的pH，同時有機弱酸環境還能夠防止花色苷的降解，而且用于食品著色是無毒的[13]，因此，選0.5%檸檬酸溶液做為提取溶劑。

圖3 提取溶劑對花色苷得率的影響Fig.3 Effectof differentextraction solvents on the yield of anthocyanin from purple yam

2.3.2 檸檬酸濃度對花色苷得率的影響 不同檸檬酸濃度對紫薯蕷中花色苷得率的影響如圖4所示。由圖4可見，當檸檬酸濃度在3.0%以內時，紫薯蕷花色苷得率隨檸檬酸濃度的增加而增加，但當檸檬酸濃度繼續增大時，花色苷得率反而下降，這可能由于花色苷本身的分子結構的特殊性，在花色苷提取過程中加入一定濃度的酸能夠防止提取過程中非酰基化的花色苷降解，而當酸濃度過大時，又會導致酰基化的花色苷部分或全部的水解，因此選擇適當的酸度在花色苷的提取過程中是相當重要的，根據圖4選擇3.0%的檸檬酸溶液作為最佳的提取溶劑。

圖4 檸檬酸濃度對花色苷得率的影響Fig.4 Effect of citric acid concentration on the yield of anthocyanin from purple yam

2.3.3 料液比對花色苷得率的影響 由圖5可知隨著溶液量的增加，紫薯蕷花色苷得率不斷增大，但當增加到一定程度后，花色苷得率趨向于平衡。這是因為隨著溶液量的增加，紫薯蕷中的色素可以不斷溶出，直至被提取完全，因此花色苷得率也逐漸升高，料液比達到1∶20g/m L以后花色苷得率不再增加，故確定1∶20g/m L的料液比為最佳。這是因為當擴散達到平衡時，花色苷被提取完全，提高提取劑增量不會促進花色苷的提取，反而使之后的濃縮更為困難。

圖5 料液比對花色苷得率的影響Fig.5 Effectofmaterial-liquid ratio on the yield of anthocyanin from purple yam

2.3.4 提取溫度對花色苷得率的影響 由圖6可知，花色苷得率隨溫度的變化有一個先上升后下降的過程，當溫度低于70℃時，隨溫度的增加花色苷得率明顯增大，溫度高于70℃后，花色苷得率隨溫度的增加而降低。這是由于隨著溫度的逐漸升高，溶液擴散速度加快，溶劑對花色苷的溶解度逐漸增加，但是超過一定溫度后，由于花色苷耐熱性較差，在高溫下結構易發生變化而造成花色苷得率下降，故選擇70℃作為最佳提取溫度。

2.3.5 提取時間對花色苷得率的影響 不同提取時間對紫薯蕷花色苷得率的影響如圖7所示。結果表明，隨著提取時間的延長，紫薯蕷色素的得率逐漸增加，但超過2.0h后，得率逐漸下降。這是由于隨著時間的增加，溶解在溶劑中的花色苷越來越多，但是花色苷類色素提取時間過長時，會因環境中的光、氧氣和微生物等作用，導致其穩定性下降。由圖7可知，選擇紫薯蕷花色苷提取的最佳時間為2.0h。

圖6 提取溫度對花色苷得率的影響Fig.6 Effectof temperature on the yield of anthocyanin from purple yam

圖7 提取時間對花色苷得率的影響Fig.7 Effect of extraction time on the yield of anthocyanin from purple yam

2.4 BBD響應面實驗設計

采用Design-Expert軟件中的BBD響應面進行實驗設計考察，本次實驗共有27個實驗點，分為兩類：其一是析因點，自變量取值在各因素所構成的三維頂點，共有24個析因點；其二是零點，為區域的中心點，零點實驗重復3次，以花色苷得率為響應值，結果見表3。

2.5 建立模型方程與方差分析

應用Design-Expert 8.0.6軟件對表3中的數據進行二次回歸方程擬合，得到檸檬酸濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）與花色苷得率之間的二次多項回歸方程：Y=0.57+0.032A+5.000×10-3B+9.083×10-3C+0.011D-1.250×10-3AB-9.250×10-3AC-2.750×10-3AD-2.500×10-4BC-0.023BD+1.250×10-3CD-0.011A2-0.022B2-0.024C2-0.016D2。

對上述回歸模型進行顯著性檢驗，結果見表4。

由表4可知，該回歸模型極顯著（p＜0.0001），且方程的失擬項不顯著，表明該方程對實驗擬合情況較好，實驗誤差小。模型決定系數R2=0.9711，說明響應值（花色苷得率）的變化有97.11%來源于所選變量，即檸檬酸濃度、提取時間、料液比、提取溫度。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳提取條件。回歸方程中各自變量對指標（響應值）影響的顯著性，由F檢驗來判定，概率p的值越小，則相應變量的顯著程度越高。A、BD、B2、C2對紫薯蕷花色苷得率有著極其顯著的影響，C、D、AC、A2和D2對紫薯蕷花色苷得率有著顯著的影響，檸檬酸濃度與提取時間、檸檬酸濃度與料液比、檸檬酸濃度與提取溫度、提取時間與料液比、提取時間與提取溫度、料液比與提取溫度4個因素之間交互作用對花色苷得率的影響如圖8～圖13所示。由圖8可以看出，花色苷得率隨檸檬酸濃度的增大及提取時間的延長而增大，但二因素編碼值達到一定組合值后，得率呈緩慢下降的趨勢，二者交互作用不顯著。由圖9可以看出，花色苷得率隨檸檬酸濃度及料液比的變化而變化，檸檬酸濃度增加，花色苷得率先增后減，且變化幅度較大；隨著料液比的增加，花色苷得率先增后減，且變化幅度較小，二者交互作用不顯著。由圖10可知，花色苷得率隨檸檬酸濃度與提取溫度的變化而變化，檸檬酸濃度增加，得率有所增加，在高于2.8%左右時趨于平緩，提取溫度升高，得率隨之增加，在高于65℃左右時趨于平緩，二者交互作用顯著。由圖11可知，提取時間與料液比之間的交互關系不顯著，表現為曲面較為平緩。由圖12可知，提取時間與提取溫度間的交互關系非常顯著，表現為曲面較陡。而由圖13可知料液比與提取溫度之間的交互關系不顯著，表現為曲面較平緩。

表3 紫薯蕷中花色苷提取BBD響應面實驗設計及結果Table3 Box-Behnken design and results for response surface analysis for extraction of anthocyanin from purple yam

圖8 檸檬酸濃度與提取時間對花色苷得率影響的響應面圖Fig.8 Response surface plots of the yield of purple yam anthocyanin showing the effectof citric acid concentration and extraction time

表4 回歸模型方差分析Table4 Analysis of variance of the quadratic polynomialmodel

圖9 檸檬酸濃度與料液比對花色苷得率影響的響應面圖Fig.9 Response surface plots of the yield of purple yam anthocyanin showing the effectof citric acid concentration and material-liquid ratio

圖10 檸檬酸濃度與提取溫度對花色苷得率影響的響應面圖Fig.1 0 Response surface plots of the yield of purple yam anthocyanin showing the effectof citric acid concentration and extraction temperature

圖11 提取時間與料液比對花色苷得率影響的響應面圖Fig.1 1 Response surface plots of the yield of purple yam anthocyanin showing the effectof extraction time and material-liquid ratio

2.6 響應面分析及最優提取條件的確定

通過軟件分析，得到紫薯蕷花色苷提取的最佳條件為：檸檬酸溶液2.79%，提取時間2.42h，料液比1∶19.86g/m L，提取溫度64.74℃，在此條件下，紫薯蕷花色苷得率預測值為0.586%。為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化條件提取紫薯蕷花色苷，考慮到實際操作的便利，將提取參數修正為：檸檬酸溶液3.0%，提取時間2.5h，料液比1∶20.0g/m L，提取溫度65.0℃。在此修正條件下，實際測得的花色苷得率為0.574%，實際測定值比理論預測值低0.012%。該工藝合理、可行。

圖12 提取時間與提取溫度對花色苷得率影響的響應面圖Fig.1 2 Response surface plots of the yield of purple yam anthocyanin showing the effectof extraction time and extraction temperature

圖13 料液比與提取溫度對花色苷得率影響的響應面圖Fig.1 3 Response surface plots of the yield of purple yam anthocyanin showing the effectofmaterial-liquid ratio and extraction temperature

3 結論

采用回流提取法對紫薯蕷中的花色苷進行提取，通過單因素實驗和Box-Behnken設計實驗優化了提取工藝，得到回流提取紫薯蕷中花色苷的最佳工藝為檸檬酸溶液濃度3.0%，提取時間2.5h，料液比1∶20.0g/m L，提取溫度65.0℃，在此條件下實際測定得到的花色苷得率為0.574%。

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