響應面法優化三氯乙酸脫除滑子菇粗多糖蛋白質的工藝

臧玉紅，李仁杰

（1.承德石油高等專科學校化工系，河北承德067000；2.中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇南京211196）

食用菌多糖是食用菌最重要的功能性物質之一，具有多方面的生物活性，如抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗潰瘍、抗衰老、抗輻射等生理功能。且對防止軟骨病、預防感冒、降低血清膽固醇、增強免疫等也有良好的效果[1-4]。因此，近年來對提取食用菌多糖的研究越來越引起人們的關注。但要想對多糖的組成、結構和功能等進行更深入的研究，還需對粗多糖進行純化，在多糖雜質中，影響最大、最難除去的雜質就是蛋白質，因為蛋白質不僅能與多糖形成復合物，增加對多糖的吸附性，而且蛋白質還具有熱源性，影響多糖的分離，所以脫除蛋白質是純化多糖的關鍵[5]。

目前，常用于脫除蛋白質的方法主要有：Sevag法、氯化鈉法、殼聚糖絮凝法、三氯乙酸法（TCA）[5]、鹽酸法、三氟三氯乙烷法、蛋白酶法[6]、超濾法[7]、大孔樹脂法[8]等。經研究，每種脫除蛋白的方法各具特點[9-10]，徐韌博等[5]對三氯乙酸法純化多糖有一定的研究，但目前采用響應面法，對多糖的保留率及蛋白質的脫除率進行雙響應值分析，純化滑子菇多糖的優化工藝還未見報道，本實驗采用三氯乙酸法，選擇多糖溶液與三氯乙酸的比例（料液比）、脫除時間、三氯乙酸濃度等作為考察因素，在單因素實驗基礎上，采用三因素三水平的Box-Behnken確定多糖純化條件，以蛋白質脫除率和多糖保留率作為評價指標，利用響應面擬和所得方程對滑子菇多糖純化工藝進行優化，確定多糖保留率和蛋白質脫除率的最佳工藝，為滑子菇粗多糖的進一步純化提供了科學依據，并且為合理地開發和利用滑子菇資源奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滑子菇 市場采購；鹽酸、氫氧化鈉、正丁醇、95%乙醇、三氯甲烷、蒽酮、硫酸、葡萄糖、丙酮、三氯乙酸、苯酚等 均為分析純；考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白 為生化試劑。

101-2型干燥箱 鄭州市萬博儀器設備有限公司；組織搗碎機 上海比朗儀器有限公司；80-2B型離心機 上海安寧科學儀器廠；HH-6型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；SHB-B型真空抽濾機 鄭州長城科工貿有限公司；KDM型電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；721型及722型分光光度計 上海第三分析儀器廠；JY3002型電子天平 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 三氯乙酸法脫除滑子菇多糖蛋白質的工藝流程圖 滑子菇→粉碎→過篩→（脫脂）→稱重→熱水浸提→抽濾→濾液濃縮→醇沉→洗滌→烘干→粗多糖→加入TCA→靜置→醇沉→離心→冷凍干燥→脫蛋白質多糖。

1.2.2 多糖含量的測定 苯酚-硫酸法[11-12]。標準葡萄糖溶液用苯酚-硫酸試劑處理后，在490nm處測吸光度，以葡萄糖質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，再測定待測樣品溶液的吸光度，根據回歸方程計算出相應的濃度，從而求出多糖的含量。

1.2.3 蛋白質含量的測定 采用考馬斯亮藍法[5-6，13]。以牛血清蛋白為標準，在595nm處測吸光值，以蛋白質濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 計算方法

1.2.4.1 多糖保留率 計算公式為：

其中：Y1—多糖保留率（%）；A0—為初始樣品中多糖的含量；A1—為脫除蛋白后樣品中多糖的含量。

1.2.4.2 蛋白質脫除率計算[14]計算公式為：

其中：Y2—蛋白質脫除率；C0—為初始樣品中蛋白質的含量；C1—為除蛋白處理后樣品中蛋白質的含量。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 多糖溶液與三氯乙酸的比例（料液比） 將10mg/m L滑子菇粗多糖溶液與10%的三氯乙酸試劑分別于3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的體積比混合，靜置60m in后，醇沉、3500r/m in離心10m in，分別測定蛋白質及多糖的含量，確定料液比對蛋白脫除率及多糖保留率的影響。

1.2.5.2 三氯乙酸濃度的選擇 將滑子菇多糖提取液分別與1%、3%、5%、7%、9%、12%、15%（W/W）的TCA，充分搖勻后，靜置60m in后，醇沉、3500r/m in離心10min，分別測定多糖和蛋白質的含量，確定三氯乙酸濃度對脫蛋白率及多糖保留率的影響。

1.2.5.3 脫除時間 將滑子菇多糖提取液與10%的TCA按1∶2混合后分別靜置10、30、50、70、90、120、150min，醇沉、3500r/min離心10min，分別測定多糖和蛋白質的含量，確定作用時間對脫蛋白率及多糖保留率的影響。

1.2.6 響應曲面優化實驗 在單因子實驗的基礎上采用中心組合實驗Box-Behnken進行方案設計[15-19]，優化脫蛋白工藝。選擇料液比，脫蛋白時間，三氯乙酸濃度三個因素為自變量，分別以X1、X2、X3表示，并以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平進行編碼，以蛋白質脫除率、多糖損失率為響應值，因素編碼及水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平及編碼Table1 Factors and coded levels in the Box-Behnken experimental design

2 結果與討論

2.1 多糖含量測定和蛋白質含量測定的標準曲線

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose

圖2 蛋白質測定標準曲線Fig.2 The standard curve of protein

根據實驗方法，得到多糖含量與吸光值的標準曲線如圖1所示。蛋白質含量與吸光值的標準曲線如圖2所示。

2.2 TCA法脫除蛋白單因素實驗

2.2.1 滑子菇多糖提取液與三氯乙酸比例（料液比）對蛋白質脫除率及多糖保留率的影響 結果如圖3所示。通過圖3分析可知，料液比對蛋白質的脫除率和多糖的保留率都有比較明顯的影響，其中蛋白質的脫除率隨著料液比的升高呈現上升趨勢，而糖的保留率則呈下降趨勢，料液比1∶1后，脫除蛋白的能力緩慢增加，但多糖損失率則明顯下降，綜合考慮，多糖樣品與TCA的比值在1∶2附近較好。

圖3 料液比對蛋白質脫除率和多糖保留率的影響Fig.3 Effectof solid-liquid ratio on the removal protein yield and polysaccharide

2.2.2 三氯乙酸濃度對蛋白質脫除率及多糖保留率的影響 結果如圖4所示。通過分析可知，TCA濃度變化對脫除蛋白質及多糖的保留值都有顯著的影響，增加TCA用量可以明顯提高蛋白質的脫除率，但多糖損失率也在顯著增加。當TCA用量7%以上時，隨TCA濃度繼續增加，蛋白質脫除率增加緩慢，而多糖保留率則大幅度下降，從蛋白質的脫除率及多糖保留率兩方面綜合考慮，6%的TCA濃度能對滑子菇多糖中蛋白質的脫除有較好的效果，且多糖保留率較高。

圖4 TCA濃度對蛋白質脫除率及多糖保留率的影響Fig.4 Effectof concentration of TCA on the removal protein yield and polysaccharide retention yield

2.2.3 作用時間對蛋白質脫除率及多糖保留率的影響 結果如圖5所示。由圖5分析可知，TCA與多糖提取液混合后靜置時間對多糖和蛋白質都有影響，開始時，隨著靜置時間的延長，蛋白質的脫除效果明顯增大，60m in后，蛋白質脫除趨于平穩，而多糖的保留率則繼續下降，綜合考慮，60m in是最佳處理時間。

圖5 TCA作用時間對蛋白質脫除率及多糖保留率的影響Fig.5 Effect of TCA role of times on the removal protein yield and polysaccharide retention yield

2.3 響應曲面的設計實驗

按照表1的Box-Behnken實驗設計方案進行3因素與3水平實驗，結果如表2所示。

Table2 Box-Behnken實驗設計與結果Table2 Box-Behnken experimental designmatrix and experimental results

2.4 回歸模型的建立及其顯著性檢驗

利用Design Expert 8.05b軟件對表2的實驗數據進行多元回歸擬合，獲得多糖保留率（Y1）和蛋白質脫除率（Y2）對自變量料液比（X1）、脫除時間（X2）、TCA濃度（X3）的二次多項回歸方程為：

多糖保留率（Y1）和蛋白質脫除率（Y2）的回歸方程方差分析及模型系數顯著性檢驗結果分別見表3和表4所示。

通過表3分析可知，該模型中各因素對滑子菇多糖保留率影響的程度分別為：X1、X2、X3、X影響高度顯著；X、X影響極顯著；X1X2、X2X3影響顯著；而只有X1X3影響不顯著。所考察因素的顯著性排序為：X2、X1、X3，即：作用時間、樣液與TCA的比值、TCA濃度。

表3 多糖保留率（Y1）回歸方程模型方差分析及方程系數顯著性檢驗Table3 Analysis of variance and significance test for each of the fitted regression equationmodel of the polysaccharide retention yield（Y1）

表4 蛋白質脫除率（Y2）回歸方程模型方差分析及方程系數顯著性檢驗Table4 Analysisofvariance and significance test foreach of the fitted regression equationmodel of the removal protein yield（Y2）

由表4分析可知，該模型中各因素對脫除蛋白質影響的程度分別為：X1、X3、X影響高度顯著；X2、X1X3、X、X影響極顯著；X1X2影響顯著；而只有X2X3影響不顯著。所考察因素的顯著性排序為：X1、X3、X2，即：樣液與TCA的比值、TCA濃度、作用時間。

由表3、表4綜合分析可知，Y1、Y2回歸模型的R2分別為0.9910、0.9880，R分別為0.9795、0.9727，說明該模型的擬合度非常好，p值均＜0.0001，表明此模型是高度顯著的，可以采用回歸模型對響應值多糖的保留率（Y1）和蛋白質的脫除率（Y2）進行預測，說明該模型是有意義的。該模型失擬項的p值分別為0.0560、0.0819（p＞0.05），說明其影響不顯著，即失擬項與純誤差沒有顯著差異，則說明實驗操作可信，可以用回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析和預測。

2.5 響應面分析

根據回歸方程，作響應曲面圖，考察所擬合響應曲面的形狀，分析各影響因素對多糖保留率和蛋白質脫除率的影響以及各因素間的交互效應，如圖6（a～f）所示。各圖顯示作用時間、料液比、TCA濃度中任意兩個變量編碼為零水平時，其余兩個變量對多糖保留率的影響（圖6a～c）和對蛋白質脫除率的影響（圖6d～f）。

從圖6（a～f）中可以看出，當三個因素中任意一個因素取中間值，其余兩個因素同時變化時，隨著二者的增加，多糖保留率Y1均呈現比較明顯的下降趨勢，而蛋白質脫除率Y2則呈現明顯的上升趨勢。其中，圖6（e）的曲面最陡峭，表明TCA濃度和料液比之間對蛋白質脫除率交互性最強，圖6（a）、圖6（c）、圖6（d）曲面較陡峭，而圖6（b）、圖6（f）曲面坡度較為緩慢，表明脫除時間和料液比之間對多糖保留率、蛋白質脫除率均有較強的交互作用，脫除時間和TCA濃度對多糖保留率有較強的交互作用，這與方差分析的結果相一致。

根據Box-Behnken實驗所得到的數據結果和回歸方程，利用Design Expert 8.05b軟件處理所得數據，從中可以獲得一組最佳工藝參數：料液比1∶2.76，作用時間51.96m in，TCA濃度5.78%，在此條件下，多糖保留率預測值為75.40%，蛋白質脫除率為84.39%。根據實際情況，確定料液1∶3，作用時間50min，TCA濃度6%，實際測得多糖保留率為75.08%，蛋白質脫除率為84.16%，與預測值接近，可見該模型對滑子菇多糖保留效果和蛋白質的脫除效果能進行較好的預測。

3 結論

3.1 在單因素實驗的基礎上，采用響應面分析法對主要影響因素進行中心組合設計實驗，并利用Design Expert 8.05b軟件對實驗數據進行多元回歸擬合，通過方差分析，得到該模型中各因素對滑子菇多糖保留率影響的顯著性排序為：X2、X1、X3，即：作用時間、樣液與TCA的比值、TCA濃度。對蛋白質脫除率影響顯著性排序為：X1、X3、X2，即：樣液與TCA的比值、TCA濃度、作用時間。

圖6 各因素交互作用對多糖保留率（a～c）和蛋白質脫除率（d～f）的影響Fig.6 The effectof experimental factors interaction on the polysaccharide retention yield（a～c）and the removal protein yield（d～f）

3.2 根據回歸方程對多糖保留率和蛋白質脫除率兩個方面進行考核，得到三氯乙酸法純化滑子菇多糖的最佳工藝參數為：多糖提取液與TCA體積比為1∶3，脫除時間為50min，TCA濃度為6%，在此條件下多糖保留率為75.08%，蛋白質脫除率為84.16%，與預測值接近，可見該模型對滑子菇多糖保留效果和蛋白質的脫除效果能進行較好的預測。

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