多穗柯中二氫查耳酮絮凝純化工藝的優(yōu)化

王慧瑩，楊棟梁，劉佳佳，孫振宇，劉 昶，劉 雄

（中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長沙410083）

多穗柯（Lithocarpus polystarch）又名甜茶，是一種藥食兩用、兼有茶、糖、藥3種功能的植物，是一種適應(yīng)性比較強的速生樹種[1]。多穗柯的嫩葉因二氫查耳酮含量豐富而具有清爽的甜味，甜味成分主要是根皮苷、三葉苷和3-羥基根皮苷等二氫查爾酮苷類[2]。據(jù)文獻報導(dǎo)，Whanchul等[3]對具有甜味的二氫查耳酮的分子結(jié)構(gòu)進行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)分子結(jié)構(gòu)中2羥基與羰基形成分子內(nèi)氫鍵時，常常具有很強烈的甜味，且是蔗糖的幾百倍以上。Tsujihara等[4]以根皮苷為前體合成的4-甲氧基根皮苷對糖尿病有很強的抑制作用；研究報道，根皮素體外能夠抑制Molt-4人白血病細胞的生長，體內(nèi)可以抑制Fisher膀胱癌細胞的生長；Kobori等[5-6]研究了根皮素致癌細胞死亡的機理。

多穗柯中二氫查耳酮含量豐富并且提取工藝較為簡單，因此多穗柯的葉可以作為二氫查耳酮的來源植物加以利用。天然甜茶多穗柯中二氫查耳酮的提取方法已有國內(nèi)文獻報道，但已有方法的最大弊端在于使用聚合氯化鋁作為絮凝劑。二氫查耳酮作為一種食品添加劑，鋁離子的殘余會對人體造成很大危害，長期攝入過量的鋁會造成記憶力減退、注意力不集中、反應(yīng)遲緩甚至導(dǎo)致老年癡呆癥等疾病，這使二氫查耳酮甜味劑的保健作用失去意義。本實驗采用殼聚糖作為絮凝劑，從根源上消除了鋁離子，成本較低、安全無毒并且絮凝效果更好。實驗中用殼聚糖絮凝劑和聚合氯化鋁絮凝劑進行對比，研究了殼聚糖作為絮凝劑的最佳用量和最優(yōu)條件，并用Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)曲面法對實驗數(shù)據(jù)進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖（分子量161.2） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司，AR；聚合三氯化鋁 天津市大茂化學(xué)試劑廠，AR；根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品 SIGMA公司，HLPC≥98%；多穗柯葉（Lilhocarpus Polystachys Rehd） 于2012年4月采自湖南邵陽，采后用水沖洗，葉片在烘箱中于50℃烘至手可捏碎，粉碎過篩，收集過100目篩部分，放置干燥處保存?zhèn)溆茫瑒⒓鸭呀淌冢ㄖ心洗髮W(xué)）鑒定。

ME5-F型百萬分之一電子天平 賽多利斯；Agilent 1100型高效液相色譜儀 安捷倫；UV2550型紫外-可見分光光度計 島津；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城；CAV264C型精密電子天平、Starter 2C型酸度計 美國奧豪斯；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物的制備 水提取法進行浸提[7]（料液比1∶8）：多穗柯樣品于50℃干燥4.5h，精確稱取約30.0g，加入蒸餾水240m L，在80℃條件下提取60min，用紗布過濾，收集濾液平均分成3份；取一份直接抽濾檢測（即無絮凝劑），然后濃縮烘干測二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。剩下2份分別用殼聚糖和聚合氯化鋁兩種絮凝劑進行處理。

1.2.2 絮凝劑的選擇

1.2.2.1 殼聚糖絮凝劑 制取醋酸濃度為1.1%的醋酸溶液90m L。取1g殼聚糖，加入10m L去離子蒸餾水潤濕、浸泡。15min后，將制好的醋酸溶液加入其中，攪拌直到殼聚糖溶解，再將溶液經(jīng)超聲（超聲功率為100W）處理20min，經(jīng)雙層紗布過濾，即得供實驗用的殼聚糖絮凝劑。向多穗柯水提取液中以0.5m L（每g干藥）的比例加入殼聚糖絮凝劑，令提取液pH為6，溫度為25℃（室溫），以40r/m in攪拌60m in，抽濾[8]；再用分光光度儀分別測量其620nm處的吸光度，計算透光率（A=log1/T）和283nm處的吸光度，并計算二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.1.2 聚合氯化鋁絮凝劑 提取液中加入適量聚合氯化鋁，pH=7.5，溫度為60℃，靜置1h[9]，抽濾；再用分光光度儀分別測量其620nm處的透光率和283nm處的吸光度，并計算二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3 二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，并用蒸餾水準(zhǔn)確定容至50m L，搖勻。分別精密吸取根皮苷標(biāo)液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0m L于10m L容量瓶中，用蒸餾水定容，靜置30m in后搖勻，采用HPLC色譜測定，每次進樣20μL，每個質(zhì)量濃度梯度平行測定3次。

HPLC色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18（250mm×416mm，5μm）；流動相：乙腈∶水=25∶75；體積流量：1m L/m in；檢測波長：283nm；柱溫：25℃，進樣量：20μL。

以根皮苷標(biāo)液質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)、峰面積A為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程：

1.2.3.2 HPLC法計算二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù) 根據(jù)計算所得的線性回歸方程計算經(jīng)絮凝劑處理之后的提取液的二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中：A為絮凝后的樣品在波長283nm處的峰面積，A0為標(biāo)液在波長283nm處的峰面積，ρ0為標(biāo)液的質(zhì)量濃度，L為絮凝之后的提取液體積。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 單因素實驗

1.3.1.1 絮凝劑用量的影響 水提取液pH 6，絮凝時間60m in，溫度25℃，絮凝劑用量設(shè)定0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8m L六個水平梯度，考察絮凝劑用量對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。每個實驗點做三次重復(fù)。

1.3.1.2 水提取液pH的影響 絮凝劑用量0.5m L/g（干藥），絮凝時間60m in，溫度25℃，水提取液pH設(shè)定5.0、5.5、6.0、6.5、7.0五個水平梯度，考察水提取液pH對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。每個實驗點做三次重復(fù)。

1.3.1.3 絮凝時間的影響 絮凝劑用量0.5m L/g（干藥），水提取液pH6，溫度25℃，絮凝時間設(shè)定20、40、60、80、100m in五個水平梯度，考察絮凝時間對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。每個實驗點做三次重復(fù)。

1.3.1.4 絮凝溫度的影響 絮凝劑用量0.5m L/g（干藥），水提取液pH6，絮凝時間60min，絮凝溫度設(shè)定20、25、30、35、40、45℃六個水平梯度，考察絮凝溫度T對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。每個實驗點做三次重復(fù)。

1.3.2 Box-Behnken實驗設(shè)計 應(yīng)用Design Expert軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為響應(yīng)值，在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，綜合考慮實際生產(chǎn)的需要，對絮凝劑用量、水提取液pH、絮凝時間三因素進行響應(yīng)曲面實驗設(shè)計，因素水平見表1。每個實驗點做三次重復(fù)。

表1 三因素三水平實驗設(shè)計Table1 Factor levels for the experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 不同絮凝工藝對提取液透光率及二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

表2中數(shù)據(jù)分別為使用殼聚糖絮凝劑、聚合氯化鋁絮凝劑和不使用絮凝劑得到的水提取液測得的透光率和計算所得的二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，相對于不使用絮凝劑，兩種絮凝劑的使用都提高了二氫查耳酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但數(shù)據(jù)表明殼聚糖絮凝劑優(yōu)于聚合氯化鋁絮凝劑。

表2 不同絮凝方法對提取液透光率及二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Table2 Effectof different flocculation technologies on the light transmittance of thewater extractand themass fraction of dihydrogenchalcone

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 絮凝劑用量的確定 如圖1所示，透光率T620nm和二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)同時隨絮凝劑用量的增加而增大，在0.5m L/g（干藥）時達最大值，但絮凝劑用量繼續(xù)增加，透光率T620nm和二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)又同時減小。這是因為隨著絮凝劑加入量的增加，吸附架橋和電中和作用增強，絮凝效果逐漸達到最佳值。但加入量過高時，藥液中的微粒易被殼聚糖包圍，失去其在顆粒間發(fā)揮的架橋作用，膠體表面發(fā)生2次吸附，微粒處于再穩(wěn)定狀態(tài)，黏度和濁度變高，也增加了對藥物有效成分的吸附。因此，本實驗確定的最佳絮凝劑用量為0.5m L/g（干藥）。

圖1 絮凝劑用量對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effectof Flocculant dosage on themass fraction of dihydrogenchalcone

2.2.2 提取液pH的確定 如圖2所示，隨著提取液pH的增大，透光率T620nm和二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)同時增大，在6.0時達最大值后又逐漸下降。這是因為殼聚糖是含胺基基團的高分子長鏈化合物，在偏酸性條件下，可很好地伸展其長鏈，成為陽離型，同時發(fā)揮吸附架橋和中和作用，以達澄清。但如果溶液的pH低于6時，二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低比透光率T620nm明顯，說明可能pH對雜質(zhì)去除的影響較小，而對藥物成分含量的影響較大[10]。

2.2.3 絮凝時間的確定 如圖3所示，隨著絮凝時間的增加，高分子物質(zhì)與體系中膠體顆粒接觸概率增多，電中和、吸附架橋作用比較充分，體系的澄明度就增高，大約在60m in之后，絮凝完成，再繼續(xù)延長絮凝時間，透光率T620nm和二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本沒有變化。

圖2 水提取液pH對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effectof pH of the water extracton themass fraction of dihydrogenchalcone

圖3 絮凝時間對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect the period of the flocculation on themass fraction of dihydrogenchalcone

2.2.4 絮凝溫度的確定 如圖4所示，隨著溫度的升高，透光率T620nm和二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有較小幅度的提高，在溫度升高到35℃的時候達到最大，繼續(xù)升高溫度，透光率T620nm有小幅度的降低，但是二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻有明顯的降低。可能是因為隨著絮凝溫度提高，體系內(nèi)膠體粒子熱運動的速度也逐漸增加，與膠體顆粒的碰撞頻率增加，電中和、吸附架橋作用比較充分，因此，絮凝比較徹底。但是當(dāng)溫度過高時，沉降的速度加快，絮凝劑對體系中剩余膠體顆粒的絮凝作用往往不夠充分，絮凝劑還有可能與產(chǎn)物發(fā)生了絮凝，使二氫查耳酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。本實驗從可行性和經(jīng)濟角度考慮，選擇25℃（室溫）為最佳絮凝溫度[11]。

2.4 響應(yīng)曲面分析

表3 Box-Behnken實驗設(shè)計表Table3 The results of Box-Behnken experimental design

以絮凝劑用量、提取液pH和絮凝時間為三個可控工藝參數(shù)，二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為實驗指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計方法來優(yōu)化二氫查耳酮純化條件，實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表3。

利用Design-Expert軟件對17組實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得絮凝劑用量（A）、提取液pH（B）和絮凝時間（C）與二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Y，%）的二次多元回歸模型，如公式所示：

如表4所示，三元二次方程的相關(guān)系數(shù)為0.9850，調(diào)整確定系數(shù)Ad j R2為0.9658，說明該模型分別能解釋96.58%的響應(yīng)值變化[12]，說明該模型擬合程度良好[13]，實驗誤差小。通過回歸模型方差分析可以看出：F值為51.18，p＜0.0001，表明模型極其顯著。F值（F失擬）=22.60，p=0.057＞0.05，失擬項表明失擬不顯著。綜上所述，該模型可以用此模型對殼聚糖絮凝多穗柯水提液工藝進行分析和預(yù)測。對方程的回歸系數(shù)顯著性分析可知，A、B、C、A2、B2其p＜0.01，表明該幾項的影響有極顯著差異；AB、C2的p＜0.05，說明該幾項的影響差異顯著；AC、BC其p＞0.05，表明這兩項無顯著影響[14]。因此，可以在α=0.05顯著水平對回歸模型進一步的多元回歸分析，剔除其中的不顯著項，得到簡化后的回歸模型，即：

F值可以反映各因素對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的重要性，F(xiàn)值越大表明對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響越大，即重要性越大。表4中，F(xiàn)A=140.3655，F(xiàn)B= 16.58616，F(xiàn)C=18.65753；即各因素對提取率影響程度的大小順序為：A＞C＞B即：絮凝劑用量＞絮凝時間＞提取液pH。

在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)得到的回歸二次方程，利用Design Expert軟件作絮凝劑用量、絮凝時間和提取液pH對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響的響應(yīng)曲面圖，分析兩個因素交互作用對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。從圖5可看出，在每組交互作用下，二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有最大值，因此說明各組交互作用均對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有影響。但各圖中兩因素對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的大小只能通過方差分析得出，而不能僅依靠等高線的疏密度判斷。

表4 殼聚糖絮凝劑回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table4 Chitosan flocculant coefficientof the regression equation testof significance

圖5 不同自變量交互作用對二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the interaction Effectof three independent variables on the content of dihydrogenchalcone

通過Design-Expert軟件分析，得到二氫查耳酮的純化最佳工藝：殼聚糖用量為0.54m L（每g干藥）（相當(dāng)于0.63g/L水提取液），pH為6.17，絮凝時間t為72.45min，該條件下二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的預(yù)測值為12.6562%。采取上述最優(yōu)條件進行實驗，同時考慮到實際操作的情況，將二氫查耳酮的純化條件修正為殼聚糖用量為0.54m L（每g干藥）（相當(dāng)于0.63g/L水提取液），pH為6.17，絮凝時間為73min，因為溫度對實驗結(jié)果幾乎沒有影響，故選擇25℃（室溫）作為絮凝溫度，實測二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.53%±0.07%。該值與理論最大值接近，說明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化二氫查耳酮純化工藝可行[16]。

3 結(jié)論

通過單因素實驗和Box-Behnken實驗設(shè)計以及響應(yīng)面分析對二氫查耳酮純化工藝進行了優(yōu)化，各因素對提取率的影響大小為：絮凝劑用量＞絮凝時間＞提取液pH，結(jié)合實際操作，確定二氫查耳酮純化的最有條件是：絮凝劑用量為0.54m L（每g干藥）（相當(dāng)于0.63g/L水提取液）、pH為6.17、絮凝時間t為73m in、溫度為25℃，得到二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為12.53%，收率為83.53%，與傳統(tǒng)絮凝劑聚合氯化鋁比較（二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.3%，收率為80.13%），二氫查耳酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了33.76%，收率提高了4.01%。

實驗后續(xù)還可以用ADS-7樹脂吸附分離，洗脫、濃縮、干燥，可得到較高純度的二氫查耳酮[17]。

天然高分子絮凝劑殼聚糖效果優(yōu)于傳統(tǒng)絮凝劑聚合氯化鋁，從源頭上排除了鋁離子殘余，安全無毒，用量也相對較少，因為溫度對絮凝效果影響不大，絮凝可在常溫下進行，無需加熱節(jié)約能源。

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