去整合素金屬蛋白酶10基因啟動子區多態性變化與腔隙性腦梗死發病風險的關系

李 友，廖 鋒，崔理立，馬國達，李克深

(廣東醫學院附屬醫院衰老與心腦疾病相關重點實驗室暨神經病學研究所，廣東湛江524001)

腦卒中是嚴重危害人類健康和生命的疾病，其發病率、致殘率及病死率均高，其中缺血性腦卒中占80%以上［1］。遺傳因素和環境因素共同參與腦卒中的發生。由腦內小血管閉塞導致的腔隙性腦梗死是腦卒中最常見的一種類型，其與腦內大中血管閉塞所致大動脈粥樣硬化性腦梗死(ACI)可能存在不同的遺傳學機制。盡管腔隙性腦梗死病變面積不大，仍可造成嚴重功能障礙，并可能是血管性癡呆的病因。去整合素金屬蛋白酶(ADAMs)家族為Ⅰ型跨膜蛋白，參與細胞增殖分化及胞外基質重建、血管形成、細胞遷移等，與炎癥、惡性腫瘤、阿爾茨海默病(AD)及動脈粥樣硬化等多種疾病的病理過程相關［2］。ADAM10是ADAM家族的重要成員，越來越多的證據表明其可能在動脈粥樣硬化的形成和發展過程中起重要作用［3］。ADAM10基因啟動子區的多態性可調節其表達［4］，且已被證實與AD及行為紊亂等疾病相關［5，6］。目前，國內外有關 ADAM10多態性與腔隙性腦梗死的相關報道鮮見。本研究采用病例對照方法分析了ADAM10基因啟動子區多態性與腔隙性腦梗死的相關性。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象為2011年2月～2012年9月于我院神經內科診治的173例腔隙性腦梗死患者(梗死組)，男117例，女56例;年齡(69.89± 9.78)歲，其中≥70歲96例、＜70歲77例。均符合全國第四屆腦血管病會議修訂的診斷標準，并經頭顱CT/MRI檢查證實，梗死灶直徑均＜15 mm。對照組為297例性別及年齡匹配的本院非心腦血管疾病門診體檢者，男192例，女105例;年齡(69.67± 8.63)歲，其中≥70歲151例、＜70歲146例。剔除標準:伴房顫、血液病、結核、惡性腫瘤、大動脈炎、周圍血管疾病、周圍血管栓塞性疾病及嚴重肝腎功能不全者。該研究得到醫院倫理委員會批準，受試者均被告知研究目的，并簽署知情同意書。

1.2 基本資料收集及檢測 通過問卷訪談收集兩組吸煙史、高血壓史、糖尿病史，采用自動化酶標儀測定血糖、血脂水平。

1.3 ADAM10基因啟動子區多態性檢測

1.3.1 血液標本采集及基因組DNA提取 兩組均禁食12～14 h，抽取清晨空腹外周靜脈血3～5 mL，EDTA抗凝后-20℃保存。取全血0.5 mL，按照北京天根公司血液基因組DNA提取試劑盒的說明提取基因組DNA，-20℃保存。

1.3.2 基因型檢測 采用Snapshot法。選擇已報道的ADAM10啟動子區的多態位點 rs653765和rs514049［11］，在上海天昊生物科技有限公司進行基因型檢測。用于多重PCR擴增的引物以Primer 3在線軟件設計合成，具體序列:rs653765正義鏈為AGCACCTCCCTCTCGCTCCAC，反義鏈為TGCATTTATGTTCGCATCACTGG;rs514049正義鏈為AGCACCTCCCTCTCGCTCCAC，反義鏈為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGAAGAAAAAAAACCTCTGTTACTTGTGAC。PCR反應體系為20μL:10×HotStarTaq buffer 2.0μL，3.0 mmol/L的Mg2+4.0μL，上下游引物分別為20 pmol，0.3 mmol/L的dNTP 0.5 mmol，HotStarTaq polymerase 1.0 U，樣本DNA 0.2～0.5 μg及滅菌去離子水適量，應用自動循環儀進行擴增;擴增條件:95℃2 min;94℃20 s，65℃40 s，72℃90 s，11個循環;94℃20 s，59℃30 s，72℃90 s，24個循環;72℃2 min;4℃保存。PCR產物純化:在15μL的PCR產物中加入5 U蝦堿酶(SAP)和2 U ExonucleaseⅠ酶，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min。基因型檢測:①延伸產物(10μL)與1 U的SAP混合后于37℃孵育1 h，75℃滅活15 min;②取純化后的產物0.5μL、9μL的 Hi-Di及0.5μL的Liz120混勻，95℃變性 5 min;③上樣于ABI3130XL測序儀中，使用GeneMapper v4.1軟件對實驗結果進行分析。

1.4 頸動脈內膜中層厚度(CIMT)測量 采用B型彩色多普勒超聲儀，探頭中性頻率為10 MHz。測量管腔與血管內膜交界面到血管中膜與外膜交界面之間的垂直距離(取不同位點最大值)，分別測量兩側頸總動脈前后壁值后取其平均值。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行統計分析。使用HWE程序檢測Hardy-Weinberg平衡;基因型及等位基因頻率均使用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行分析;用獨立樣本t檢驗或χ2檢驗對各個危險因素進行分析;用方差分析評價ADAM10不同基因型與腔隙性腦梗死之間的關系;用獨立樣本t檢驗分析ADAM10基因多態性與CIMT的關系。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基本資料比較 梗死組吸煙史、高血壓史比例及血糖水平均顯著高于對照組(P均＜0.01)，高密度脂蛋白(HDL)和總膽固醇水平均顯著低于對照組(P均＜0.01);兩組甘油三酯和低密度脂蛋白(LDL)水平無顯著差異(P均＞0.05)。

2.2 兩組ADAM10基因啟動子區多因型及等位基因頻率比較 兩組 ADAM10基因 rs653765和rs514049位點的基因型分布經χ2檢驗均符合Hardy-Weinberg平衡，可進行候選基因的關聯分析。梗死組ADAM10基因rs653765位點CC基因型頻率顯著低于對照組(P=0.008 0)、隱性模型CT+TT基因型頻率顯著高于對照組(OR=0.54，95%CI為0.36～0.81，P=0.002 9)，T等位基因頻率顯著高于對照組(OR=1.95，95%CI為1.37～2.79，P=0.000 2);兩組ADAM10基因rs653765位點的基因型頻率和等位基因頻率無顯著差異(P＞0.05)。詳見表1、2。

表1 兩組ADAM 10基因rs653765位點基因型和等位基因頻率比較(%)

表2 兩組ADAM 10基因rs514049位點基因型和等位基因頻率比較(%)

2.3 ADAM10基因多態性與不同性別人群腔隙性腦梗死發病風險的關系 梗死組和對照組男性隱性模型ADAM10基因rs653765位點CT+TT基因型頻率分別為40.17%(47/173)、28.65%(55/297)，P =0.037(OR=0.60，95%CI為0.37～0.97)，T等位基因的頻率分別為22.22%(52/173)、15.89% (61/297)，P=0.048(OR=1.51，95%CI為1.00～2.28)。ADAM10基因rs514049位點的多態性在兩組男性與女性中均未見顯著差異(P＞0.05)。

2.4 ADAM10基因多態性與不同年齡人群腔隙性腦梗死發病風險的關系 梗死組和對照組≥70歲者ADAM10基因rs653765位點CC基因型頻率分別為67.71%(65/173)、80.79%(122/297)，組間比較有顯著差異(P=0.041);隱性模型CT+TT基因型頻率分別為32.29%(31/173)、19.21%(29/ 297)，P=0.019(OR=0.50，95%CI為0.28～0.90);T等位基因頻率分別為17.19%(33/173)、10.93%(33/297)，P=0.046(OR=1.69，95%CI為1.00～2.85)。兩組ADAM10基因rs514049位點的多態性在≥70歲及＜70歲者中均未見顯著差異。

2.5 ADAM10基因多態性與梗死組CIMT的關系梗死組ADAM10基因rs653765位點基因型為CC及CT+TT者 CIMT分別為(0.135±0.047)、(0.127±0.028)cm，P=0.156;ADAM10基因rs514049位點基因型為AA及AC+CC者CIMT分別為(0.135±0.044)、(0.118±0.022)cm，P= 0.098。

3 討論

腔隙性腦梗死是腦梗死亞型之一，是發生于腦深穿通動脈(或其他微小動脈)的缺血性微梗死，近年來其發病率持續升高。以往研究認為高血壓是誘發此病最主要的原因，但目前認為除高血壓引起小動脈壁脂質玻璃樣變(玻璃樣變動脈硬化)外，顱內穿支動脈粥樣硬化也是重要病因［7］。ADAMs家族為一個包含了三十多個成員的家族，在調節細胞—細胞和細胞—基質的相互作用中至關重要。ADAM10為ADAM家族其中一員，其在許多與炎癥相關的血管細胞包括內皮細胞、成纖維細胞、白細胞內均有所表達［8］;許多與ADAM10有關的底物，如TNF-α、白介素 6受體(IL-6R)、趨化因子配體CX3CL1及L選擇素等，與脈管系統的發育、炎癥和再生過程有關，而這些過程均被認為在動脈粥樣硬化的發生、發展中具有重要作用。近年來研究［9］證實，ADAM10可通過介導TNF-α、趨化因子配體CXCL16及CX3CL1、CD44等多種細胞因子和趨化因子胞外結構域的脫落，參與血管生成、細胞遷移和反式遷移、黏附、炎癥等過程，最終影響動脈粥樣硬化的發生和發展。

ADAM10基因多態性已在許多神經系統的疾病中得到研究［6，10］。ADAM10基因 rs653765和rs514049位點的多態性被認為可調節AD患者淀粉樣前體蛋白(APP)表達［4］。以往研究［11，12］顯示，ADAM10基因翻譯起始點上游-1～-2179 bp區域具有啟動子活性，而其中的-300～-508 bp部分為其核心啟動子區，而該啟動子區內 rs653765與rs514049位點的多態性可影響AD患者的ADAM10和腦脊液中可溶性APPα水平表達，因而ADAM10基因rs653765位點C＞T多態性可能是一個功能性單核苷酸多態性(SNP)位點。生物信息學研究發現，ADAM10基因rs653765的C＞T多態位點上游1個堿基處有潛在的myc基因相關鋅指結構蛋白(MAZ)轉錄因子的結合位點。本研究顯示，AD-AM10基因rs653765位點的多態性與腔隙性腦梗死的發病相關，且攜帶rs653765位點CT基因型或T等位基因的人群，其患腔隙性腦梗死的風險顯著升高。因此，ADAM10基因rs653765位點的C＞T多態性可能影響其與轉錄因子MAZ的結合，從而影響基因表達，而這些因素可能是潛在影響ADAM10基因多態性與腔隙性腦梗死發病風險相關的原因，但其詳細機制有待進一步深入研究。

本研究針對性別和年齡亞組的研究發現，男性中攜帶ADAM10基因rs653765位點T等位基因者發生腔隙性腦梗死的風險比攜帶C等位基因者顯著升高，≥70歲人群中攜帶ADAM10基因rs653765位點CT基因型或T等位基因者患腔隙性腦梗死的風險較C等位基因者顯著升高。報道［13，14］顯示，男性腔隙性腦梗死發病率較女性高。可能原因:女性體內的雌性激素有利于膽固醇及脂蛋白代謝;人體內導致細胞老化的自由基酶的基因定位于X染色體，故男性抗自由基損傷的能力比女性弱;男性更容易暴露于吸煙、飲酒等其他危險因素中，各危險因素之間相互疊加、相互作用［15］。CIMT增厚是動脈粥樣硬化早期表現形式的一種［16］，主要由炎癥等作用于動脈血管內壁，促使彈性纖維和膠原纖維等成分過度降解，最終導致細胞和細胞外基質積聚和血管重塑引起;因與動脈粥樣硬化的進展及腦梗死的發病風險相關，被認為是腦梗死的強效預測因子［17］。本研究顯示，ADAM10基因rs653765和rs514049位點的多態性與腔隙性腦梗死患者CIMT無明顯相關。可能原因為以CIMT變化為表現形式的動脈粥樣硬化早期病變中血管重塑并不明顯。此外，盡管CIMT增厚、動脈粥樣硬化斑塊及腦梗死具有很多共同的危險因素，但這三者均為眾多因素參與且互相影響而產生的不同病理現象。因此，以后需要對更大量的樣本進行檢測，以進一步探究ADAM10基因多態性對CIMT的影響。

綜上所述，ADAM10基因rs653765位點T等位基因可能與腔隙性腦梗死的發病有關。

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