改良型生物硅膠膜對大鼠神經干細胞增殖與分化的影響

楊曉青，陳旭義，程世翔，劉英富，劉春蓉，李瑞欣，李 娜，李建國

(1天津中醫藥大學，天津300193;2武警后勤學院附屬醫院;3武警后勤學院; 4軍事醫學科學院衛生裝備研究所;5北京中日友好醫院)

神經干細胞(Neural stem cells，NSCs)是一類具有自我更新能力和多種分化潛能的細胞，體外誘導分化的成體干細胞可用于中樞神經損傷疾病及退行性神經系統疾病的治療。找到體外培養NSCs的方法并誘導其分化為特定的神經細胞，進而達到神經修復和細胞治療的目的乃當今神經科學界的研究熱點之一。目前，體外培養及誘導NSCs向神經元方向分化的方法很多，力學因素對NSCs增殖與分化的影響也頗受關注［1，2］，良好的細胞生長載體是NSCs力學生物學機理研究的基礎。本研究采用改良型生物硅膠膜作為培養載體，觀察了NSCs的增殖、生長、分化及轉歸情況，旨在為進一步觀察力學因素對NSCs增殖、誘導分化的影響提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為孕16 d的SD胎鼠，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供。實驗儀器:SA-300V型全自動高壓滅菌儀(美國賽默飛公司)，自動超純水儀(美國賽默飛公司)，普通倒置顯微鏡及照相裝置(中國奧林巴斯公司)，二氧化碳細胞培養箱(美國賽默飛公司)，倒置熒光顯微鏡及照相裝置(德國Leica公司)。實驗試劑:熒光標記二抗(Sigma公司)，神經巢蛋白(Nestin)、神經元烯醇化酶(NSE)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(Pharmingen公司)，明膠、青鏈霉素、胰島素、轉鐵蛋白和葡萄糖(國產)，含有F12的DMEM培養基及胎牛血清(FBS均購自Gibco公司。改良型生物硅膠膜厚度為0.25mm，面積為3 cm×3 cm，以環形膠圈固定于培養器底部;普通培養皿為一次性塑料培養皿，經射線消毒滅菌。

1.2 NSCs的分離及分組培養 取上述SD大鼠，乙醚麻醉后置于75%乙醇中浸泡，無菌條件下取出胚胎。D-Hanks液沖洗2次，取胎鼠大腦皮質，置入含有10%FBS的DMEM/F12培養基中，機械研磨、吹打，200目濾網過濾制成單細胞懸液。調整細胞密度為1×106/mL，并隨機分為觀察組和對照組，分別接種于鋪被明膠的改良型生物硅膠膜及普通培養皿中，置37℃、5%CO2培養箱中培養;48 h后全量換為無血清DMEM/F12培養基，并加入胰島素、轉鐵蛋白、葡萄糖繼續培養，隔天再次全量換液。

1.3 NSCs的鑒定 在原代培養48 h后對培養細胞進行Nestin免疫熒光染色鑒定，7 d后對NSCs貼壁分化的細胞進行NSE和GFAP免疫熒光染色鑒定。具體步驟:PBS緩沖液清洗3次，95%乙醇固定30 min，PBS緩沖液清洗3次，加入0.5%的Triton X-100，靜置20 min，再用緩沖液洗3次，BSA封閉20 min，分別加入相應的Nestin、NSE和GFAP一抗，37℃下反應1 h、4℃過夜，緩沖液洗3次，加入相應的熒光二抗，37℃下反應1 h，用緩沖液洗3次，甘油封片。在相差倒置顯微鏡下進行與Nestin、NSE和GFAP相應的熒光激發，觀察細胞形態學變化并拍照，在熒光顯微鏡下進行陽性細胞計數(200倍鏡下選取10個視野，取均數)。陽性細胞率=陽性細胞數/4，6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI)標記核×100%。

1.4 NSCs增殖活性檢測 培養后第1、2、3、4、5、6、7天，分別取兩組細胞以胰酶消化，調整細胞密度為1× 105/mL。兩組各取200μL細胞懸液置于24孔培養板，每孔加入5 g/L的四甲基偶氮唑藍(MTT)20μL，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中繼續培養4 h，離心、收集孔內細胞，每孔加入150μL的DMSO振蕩10 min，酶標儀490 nm波長下自動檢測吸光度值，繪制生長曲線。每組實驗均重復3次。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCs形態學變化 用含10%FBS的培養基培養24 h后，兩組均見細胞貼壁生長，并形成數十至數百個細胞組成的神經細胞球;48 h后，細胞增殖形成數百到數千個細胞組成的神經細胞球，神經球邊緣細胞出現突起并逐漸延伸至臨近的神經細胞球，其后細胞逐漸分化，并呈多種形態:具有一個或兩個長突起，胞體呈圓形或橢圓性的神經元樣細胞;具有多個突起的星形膠質樣細胞;具有多個細突起且不斷分支的少突膠質細胞樣細胞。與對照組相比，觀察組連接神經球的突起較多，且較規律(圖1-a，b，c)。電鏡下可見細胞聚集而成的神經球，邊緣有單個神經細胞向外爬出，并伸出突起與臨近細胞相連(圖2-a，b)。

圖2 電鏡下原代培養的NSCs

2.2 NSCs鑒定情況 培養48 h后，兩組神經細胞球的 NSCs特異標志物Nestin均呈陽性(紅色熒光)。貼壁生長7 d后，NSE陽性細胞的胞質及突起呈綠色，觀察組和對照組陽性細胞率分別為25.14% ±1.98%、24.67%±2.05%(P＞0.05);GFAP陽性細胞呈綠色熒光，觀察組和對照組陽性細胞率分別為59.48%±2.07%、60.87%±1.08%(P＞0.05)。

2.3 NSCs增殖情況 兩組NSCs增殖情況無顯著差異(P＞0.05)，生長曲線見圖3。

圖3 細胞生長曲線

3 討論

干細胞是個體發育過程中產生的具有多向分化潛能和自我更新能力的一類細胞。目前，利用NSCs分化而成的神經元及神經膠質細胞治療脊髓損傷、腦部損傷及腫瘤等術后導致的神經損傷已成為國內外研究的熱點［1，2］，其機制可能為神經元和膠質細胞可分泌多種營養因子、改善微環境，從而使軸突再生，使神經纖維形成髓鞘［3～5］。NSCs的誘導分化受多種因素的影響［6］，其中力學因素可影響細胞結構、功能并使其骨架重排［7，8］，亦可對胚胎NSCs產生生物力學效應、促進其發育及分化［9］。

改良型生物硅膠膜是由有機硅化合物制作的生物膜，可作為細胞生長的良好載體。本研究選取孕16 d胎鼠的大腦皮質作為細胞來源，建立胚胎NSCs的體外培養體系［10～13］，觀察組細胞接種于改良型生物硅膠膜上、對照組細胞接種于普通培養皿中。結果顯示，培養第2天，顯微鏡下兩組均可見神經細胞球生成，貼壁良好，細胞球邊緣有突起并呈輻射狀向外發出，神經細胞球NSCs特異標志物Nestin均呈陽性;培養第7天，貼壁分化的NSE、GFAP陽性細胞率分別為25%、60%左右，組間比較無顯著差異。提示兩組培養的細胞均可分化為神經元細胞及神經膠質細胞;改良型生物硅膠膜并不影響NSCs的正常分化。此外，通過MTT法檢測細胞活力所得生長曲線顯示，NSCs在改良型生物硅膠膜上的生長及增殖過程與普通培養皿中細胞較一致。提示改良型生物硅膠膜對NSCs的生長具有較好的生物相容性。值得注意的是，改良型生物硅膠膜貼壁情況較普通培養基差，仍需進一步研究并尋找一種更為優良的貼壁方法。

綜上所述，改良型生物硅膠膜對NSCs的生長、增殖及誘導分化無明顯影響，但能促進細胞之間突起的增長，可作為培養載體用于研究力學因素對NSCs增殖、誘導分化的影響。

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