pGPH1-GFP-RKIP的構建及其對白血病細胞株CCRF-CEM化療敏感性的影響

李 青，多力坤

(1武警兵團指揮部醫院，烏魯木齊830063;2新疆醫科大學第一附屬醫院)

Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是最初分離自牛腦的一種相對分子質量小、結構高度保守的胞質蛋白，屬于磷脂酰乙醇胺蛋白(PEBP)家族［1］。目前已發現，RKIP在人類和鼠、猴、雞等動物的多種組織中表達［2］。RKIP曾被認為與磷脂膜生源和脂類代謝密切相關，但近年研究［3，4］發現，該蛋白能夠通過干擾Raf與MEK的結合抑制Raf-MEK-細胞調節蛋白激酶(ERK)信號通路，從而被更名為RKIP。Raf-MEK-ERK信號通路在調節細胞生長、增殖和分化中發揮重要作用，其過度激活狀態與多種腫瘤的發生和轉移密切相關［5］，其特異性抑制分子RKIP被證實為多種腫瘤的抑制蛋白［6］。研究［7～11］表明，RKIP在多種白血病細胞中表達缺失，而其過表達能抑制兒童白血病細胞CCRF-CEM的Ras-ERK信號途徑，并誘導細胞凋亡。本研究構建了RKIP的小分子干擾RNA(siRNA)質粒表達載體，并觀察了其對白血病細胞CCRF-CEM化療敏感性的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 兒童白血病CCRF-CEM細胞系(美國ATCC);鼠抗人ERK單克隆抗體、兔抗人RKIP多克隆抗體、鼠抗人磷酸化ERK(p-ERK)單克隆抗體(美國Santa Cruz)，磷酸化核因子κB抑制蛋白(p-IκB)抗體(Cell Signalinng，MA);PE-Anti Active caspase-3 Kit(Becton-Dickinson，美國)，DNA聚合酶KOD Plus(TOYOBO，日本)，總RNA提取試劑(TRIzol，Invitrogen公司)，限制性內切酶KpnⅠ、XhoⅠ，T4 DNA連接酶、dNTP(Biolab公司);9-硝基喜樹堿(9NC，Sigma公司);第一鏈cDNA合成試劑盒(美國Invitrogen)，ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa公司)，胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術研究所)，DH5感受態細胞、DNA膠回收試劑盒、質粒小量制備試劑盒(北京天根生物技術公司)，P-glycoprotein(Pgp) H1質粒載體;蛋白垂直電泳儀(北京六一儀器廠)，FACScalibur流式細胞儀(Becton-Dickinson，美國)，倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)，電穿孔轉染儀及轉染試劑盒(Amaxa，Nucleofector Kit C，德國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 RKIP的siRNA質粒載體構建 參考Hagan等［11］研究，以RKIP的652-672核苷酸5＇-CCAGGCCGAGTGGGATGACTA-3＇為靶點，由上海吉瑪公司合成含相應shDNA的堿基序列，序列如下(下劃線部分為shDNA序列):5＇-GATCCCCCCAGGCCGAGTGGGATGACTATTCAAGAGA TAGTCATCCCACTCGGCCTGGTTTTTA-3＇;3＇-GGGGGTCCGGCTCACCCTACTGATAAGTTCTCTATCAGTAGGGTGAGCCGGACAAAATTCGA-5＇將合成的RKIP shDNA經限制性內切酶BamHⅠ和BbsⅠ進行酶切、連接，熱激轉化至感受態細胞DH5α，經抗性篩選后獲得含質粒pGPH1-綠色熒光蛋白(GFP)-RKIP的重組子，提取pGPH1-GFP-RKIP質粒并送吉瑪公司測序鑒定，選取測序正確的pGPH1-GFP-RKIP質粒用于后續試驗，菌株于-20℃保存備用。

1.2.2 重組質粒轉染 取CCRF-CEM細胞以RPMI1640培養基(含10%胎牛血清、50 IU青霉素和50 mg/L鏈霉素)培養至良好生長狀態;按照Amaxa Nucleofector操作說明，取對數生長期CCRF-CEM細胞，采用X-001程序將質量濃度約1.0μg/μL的pGPH1-GFP-RKIP和pGPH1-GFP質粒溶液各2.0μg轉染至細胞，24 h后各取1×106個細胞用FACS檢測細胞GFP轉染效率，其余細胞培養72 h后收獲，用于后續研究。

1.2.3 CCRF-CEM細胞內RKIP、p-IκBα、p-ERK表達檢測 采用 Western blotting法。參考前期研究［10］方法，取轉染pGPH1-GFP-RKIP和pGPH1-GFP 72 h后的CCRF-CEM細胞各2×106個，在冰板上用細胞裂解液裂解10min，13 000 r/min離心5min，取上清行蛋白定量;取50μg細胞總蛋白進行SDS/ PAGE電泳、轉膜。鼠抗人p-ERK抗體或兔抗人RKIP或鼠抗人ERK按1∶1 000稀釋后標記PVDF膜，4℃震蕩孵育過夜，用TBST清洗3次，用相應1∶5 000稀釋的二抗標記PVDF膜1 h，再次用TBST清洗3次，用增強型發光液37℃孵育3 min，于暗室感光膠片。

1.2.4 9NC誘導后 CCRF-CEM細胞調亡率及RKIP表達檢測 將轉染pGPH1-GFP-RKIP和pGPH1-GFP質粒72 h后的CCRF-CEM細胞各2×106個，接種于6孔板，分別以溶劑對照(聚乙二醇200)及5、10、20、50 nmol/L的9NC誘導細胞凋亡。24 h后收集上述細胞，用PE-Anti Active caspase-3 Kit檢測caspase-3活性(反映細胞凋亡水平):將受試細胞用冰PBS清洗2遍，取1×106個用0.5 mL的Cytofix/Cytosperm溶液重懸;冰板放置20 min;離心后棄Cytofix/Cytosperm溶液，取1×106個細胞用0.5 mL清洗緩沖液洗2遍;加入100μL清洗緩沖液和10 μL抗體混合重懸，室溫放置30 min;再次用1 mL的清洗緩沖液洗2次，用0.5 mL清洗緩沖液重懸，在流式細胞儀上樣檢測。同上檢測RKIP表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.0軟件進行統計學處理。計量資料以±s表示，進行單因素方差分析;細胞凋亡率的比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒構建情況 經吉瑪公司測序序列鑒定，pGPH1-GFP-RKIP重組質粒構建成功。

2.2 重組質粒轉染效率 pGPH1-GFP-RKIP和 pGPH1-GFP的轉染效率分別為90.04%、91.32%，能滿足后續實驗需求。

2.3 轉染后細胞內RKIP、p-IκBα、p-ERK表達變化與轉染對照質粒的細胞相比，轉染pGPH1-GFPRKIP的細胞 RKIP表達水平下調 92.23% ± 10.23%(見圖1)，p-ERK和p-IκBα表達明顯上調，P均＜0.05(見圖2)。

圖1 轉染后CCRF-CEM細胞RK IP表達

圖2 轉染后CCRF-CEM細胞內p-ERK和p-IκBα活性

2.4 9NC誘導后CCRF-CEM細胞凋亡率 9NC誘導24 h后，轉染pGPH1-GFP及pGPH1-GFP-RKIP的細胞凋亡率分別為58.6% ±7.5%、35.8% ± 5.8%，兩者相比，P＜0.05。

2.5 9NC誘導后CCRF-CEM細胞RKIP表達水平9NC處理 CCRF-CEM細胞 24 h后，20和 50 nmol/L兩種劑量組RKIP表達水平顯著上調，且有明顯劑量依賴性(P＜0.05)。

圖3 9NC處理后CCRF-CEM細胞RK IP表達變化

3 討論

作為一種近年新發現的ERK信號通路抑制分子，RKIP能夠通過抑制多種細胞ERK信號調節細胞增殖、分化和凋亡等生物學特性［3，4］，且在多種腫瘤的侵襲、生長、轉移等過程中發揮作用。Briner等［12］對321例食管癌患者RKIP表達水平進行的回顧性調查發現，原發腫瘤的RKIP狀態影響相應淋巴結和遠端轉移部位RKIP的表達;RKIP下調與總存活數(OS)和無病生存率(DFS)相關，是OS和DFS的獨立預后因素，抑制RKIP下調可能降低食管癌彌散。Zhao等［13］報道提出，與癌旁組織和正常食管組織相比，食管癌組織的RKIP表達顯著降低，且與腫瘤淋巴結和遠端轉移相關。Keller在進行前列腺癌體外調控基因篩查時發現，高度轉移的前列腺癌組織RKIP表達水平低于低度轉移者，RKIP表達可抑制前列腺癌侵襲、缺失則反之;體內試驗表明，RKIP是前列腺癌轉移的抑制基因，對原發腫瘤生長無影響;RKIP在非腫瘤患者前列腺中高表達，在50%原發前列腺癌中低表達，在大多數轉移癌中低表達或缺失;此外，原發前列腺癌RKIP的低表達預示早期腫瘤發生;在小鼠動物模型，RKIP的缺失誘導前列腺癌的抗放射性［14］。上述研究提示，RKIP可能在腫瘤的發生、轉移、預后中發揮重要作用。

本研究成功構建了RKIP的siRNA干擾質粒載體，并經過電轉染方法建立了CCRF-CEM細胞轉染模型，且轉染后CCRF-CEM細胞的RKIP表達顯著下調，完全可以滿足試驗要求。此為研究RKIP分子在兒童白血病細胞的生物學特征中的作用奠定了基礎。本研究還顯示，轉染后細胞p-ERK和p-IκB表達也顯著上調。提示RKIP對CCRF-CEM細胞ERK和IκB信號通路有強烈的抑制作用。此與文獻［15，16］中有關前列腺癌和結直腸癌細胞的研究結果一致。此外，在9NC處理后，RKIP轉染的CCRFCEM細胞凋亡率顯著低于對照細胞，且具有濃度依賴性。提示RKIP表達下調可增加CCRF-CEM細胞對9NC的耐藥率，9NC的抗癌作用很可能是通過上調RKIP完成的。Martinho等［17］新近研究也發現，宮頸癌對化療藥順鉑的耐藥性與RKIP低表達相關。上述研究結果說明，RKIP表達下調可能是多種腫瘤細胞對化療藥耐受的機制之一。

總之，本研究成功構建了能夠高效干擾RKIP的重組質粒載體;9NC誘導的CCRF-CEM細胞凋亡與RKIP上調相關，而RKIP干涉能降低CCRF-CEM細胞對9NC的化療敏感性。

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